Po utworzeniu hybryd pomiędzy sondą a molekułą docelową musimy usunąć niezwiązaną (z molekułą docelową) sondę która jest w roztworze którym nasiąknięty jest filtr. Jeśli nie usuniemy niezwiązanej sondy to cały filtr będzie radioaktywny i specyficzne hybrydy będą niewykrywalne (na tak dużym sygnale tła).
Niezwiązaną sondę odpłukujemy przemywając filtr kilkakrotnie buforami.
Uwaga: W Southernie i Northernie hybrydy mogą się tworzyć pomiędzy RNAmi o zbliżonej lecz nie identycznej sekwencji (np.: z tym samym genem z dwóch różnych gatunków). Ta właściwość jest wykorzystywana w badaniu genów z innych (niż sonda) organizmów lub do badania mutacji. Dlatego stosujemy odpłukowanie w warunkach o różnej ostrości ("stringency") tak aby w zależności od potrzeb odpłukać mniej lub silniej związaną sondę (o różnym stopniu homologii). Kontrolując w ten sposób ostrość płukania (Piotr : dla mnie słowo "stringency" jest OK) poprzez na przykład zwiększanie temperatury zwiększamy ostrość płukania tak, że po płukaniu zostają hybrydy o mniejszej ilości mismaczy (mismacz to miejsce niekomplementarne).