Ewentualne problemy:

Jednoniciowe RNA może tworzyć struktury drugorzędowe zakłócające rozdział na żelu. Aby temu zapobiec elektroforezę próbek RNA przeprowadzamy w warunkach denaturujących. Do denaturacji RNA powszechnie stosuje się formaldehyd, glyoxal/DMSO lub (silnie trujący) methylmercuric chloride.

Często na autoradiogramie³ pojawia się słaby sygnał hybrydyzacji leżący na wysokości rybosomalnego RNA. W takiej sytuacji, aby mieć pewność, że nie jest to niespecyficzna hybrydyzacja do rRNA należy zamiast całkowitego RNA użyć mRNA.

Granicą czułości northerna jest detekcja około5 pg analizowanego transkryptu. W przypdku transkryptów genów o wysokim poziome ekspresji 5 pg znajduje się w mniej więcej 100ng całkowitego RNA. Do hybrydyzacji używa się zwykle 10ug RNA, tak aby możliwe było wykrycie rzadkich transkryptów (stanowiących nie mniej niż 0,01% mRNA). Do analizy bardzo rzadkich transkryptów używa się frakcji poli(A)+. 3ug poli(A)+ powinno pozwolić na detekcję transkryptu mRNA stanowiącego powyżej 0,0002% frakcji poli(A)+ RNA.

Do badania poziomu ekspresji genów⁴ niezbędne jest dodawanie równej ilości RNA do każdej próbki. Określenie stężenia całkowitego RNA nie jest proste ponieważ zwykle zawiera ono zanieczyszczenia utrudniające precyzyjny pomiar spektrofotometryczny⁵. Aby potwierdzić, że do nakładanych na żel próbek dodaliśmy identyczną ilość RNA puszczamy dodatkową elektroforezę z taką samą ilościa RNA jaką planujemy do właściwej elektroforezy. Jeśli na tym testowym żelu ilości RNA w poszczególnych próbkach nie są równe to przy korygowaniu ilości nakładaneg na żel RNA należy:

• Dostosowywać ilość odpipetowanego do próbki RNA w mniejszym stopniu niż wynikałoby to z zaobserwowanych na żelu różnic (zaobserwowanych ``na oko'' lub analizując komputerowo fotografię takiego żelu). Np. zamiast dodac 40% wiecej RNA należy dodać tylko 20% więcej.
• Jeśli różnice w stężeniu RNA są ogromne, tak że do jednych próbek dodajemy ułamek ul RNA a do innych kilkadziesiąt ul RNA, to należy: odpipetować po równej ilości RNA do każdej próbki (np. po 200 ug), strącić RNA i zawiesić w identycznej objętości (wody lub formamidu).