Andrzej Wierzbicki

konspekt wykładu z genetyki ogólnej

wykład 11 „Metody genetyki molekularnej”

-powstawanie gatunków – specjacja

-definicja gatunku

-grupa organizmów podobnych do siebie i krzyżujących się ze sobą

-szereg problemów

-organizmy rozmnażające się bezpłciowo (bakterie, niektóre pierwotniaki, niektóre rośliny – apomiksja)

-organizmy, które mogą się krzyżować, ale ich potomstwo jest bezpłodne – koń+osioł=muł

-organizmy, które mogą się krzyżować i mają płodne potomstwo, ale w naturze nigdy do tego nie dochodzi (duże koty)

-organizmy o których zbyt mało wiadomo

-najlepiej ten problem rozwiązują same organizmy żywe – umieją rozpoznać własny gatunek

-do powstania gatunku niezbędna jest izolacja

-powoduje, że dwie populacje tracą łączność genetyczną i przez to mogą niezależnie ewoluować – z czasem różnice się zwiększają

-mechanizmy prezygotyczne

-izolacja behawioralna – rozpoznawanie własnego gatunku

-izolacja przestrzenna – oddzielenie przeszkodą lub różnicami środowiska

-izolacja czasowa – rozmnażanie następuje w różnym czasie

-izolacja mechaniczna – różnica w budowie narządów płciowych/kwiatów

-izolacja gemetyczna – niemożność odnalezienia się gamet

-mechanizmy postzygotyczne

-nieżywotność mieszańców – zygoty umierają na skutek niekompatybilności genetycznej

-sterylność mieszańców – niezdolność lub obniżona zdolność do rozmnażania

-specjacja zapoczątkowana izolacją – specjacja allopatryczna

-specjacja może być zapoczątkowana przez dobór rozrywający

-specjacja sympatryczna

-grupy organizmów jednego gatunku nabierają pewnych „specjalizacji” i zaczynają się od siebie coraz bardziej różnić

-przykład – zięby Darwina na Wyspach Galapagos

-jak powstają organizmy bardzo różniące się od siebie?

-zagadnienie mikro- i makroewolucji

-zawiązki złożonych struktur (oko, skrzydło) nie spełniają swojej funkcji

-w materiale kopalnym często brakuje form pośrednich

-prawdopodobnie duże zmiany ewolucyjne zachodziły szybko, a potem utrzymywały się długo z niewielkimi zmianami

-alternatywne teorie tłumaczące pochodzenie gatunków

-kreacjonizm

-pozbawione jakichkolwiek podstaw w badaniach naukowych

-szereg twierdzeń jawnie absurdalnych: wiek wszechświata to kilka tysięcy lat, na początku istniały wszystkie gatunki tylko stopniowo wymierały

-ideologia propagowana przez niektóre kościoły protestanckie, odrzucana przez Kościół Katolicki.

-tylko teoria ewolucji, choć trudna do jednoznacznego udowodnienia, nadaje sens całej biologii

-jak powstało życie?

-gdy zakładamy, że każdy organizm powstaje z innego żywego organizmu dochodzimy do problemu pierwszego organizmu żywego

-nie ma żadnych bezpośrednich danych na ten temat

-zagadnienie może bardziej filozoficzne

-można jednak próbować zgadywać jak to było na podstawie różnych aktualnych obserwacji

-próby odtworzenia waruknów sprzed miliardów lat

-wyłapywanie cech dzisiejszych organizmów wskazujących jak mógł wyglądać pierwszy

-czy życie powstało na Ziemi samo z siebie?

-racjonalne przesłanki wskazują, że powstało z cząsteczek nieorganicznych

-czy to w ogóle było możliwe? – eksperyment symulujący warunki na Ziemi 3-4 miliardy lat temu

-przypuszczalna atmosfera: metan, amoniak, woda i wodór (występują w kosmosie)

-substancje rozpuszczone w „oceanie” były analizowane: 10 różnych aminokwasów, cjanowodór, różne aldehydy

-mogą powstać zarówno białka jak i DNA – ryboza powstaje w wyniku polimeryzacji formaldehydu, adenina powstaje w wyniku przemian HCN

-jakie były pierwsze organizmy

-musiały mieć zdolność autoreplikacji

-ich budulec i materiał dziedziczny mógł być zupełnie inny niż dzisiaj

-teoria świata RNA

-wiele wskazuje, że pierwsze organizmy były zbudowane z RNA

-RNA jednocześnie koduje informacje i może być enzymem

-znanych jest szereg katalitycznych RNA

-przyjmują strukturę i mają funkcję enzymu

-niektóre mają aktywnośc polimerazy RNA

-mogą zatem same się replikować

-później organizmy zaczęły wykorzystywać białka i przerzuciły się na DNA

-inne potwierdzenia

-szereg kluczowych funkcji w komórce wykonują białka z RNA lub białka z kofaktorem nukleotydowym

-dNTP powstają zawsze z NTP

-problem błony komórkowej

-elektroforeza DNA

-rozdział DNA ze względu na wielkość

-jak się robi elektroforezę DNA

-żel z agarozy (polisacharyd z glonów, zastyga tworząc galaretkę)

-aparat do elektroforezy i zasilacz

-bufor

-sposób wizualizacji DNA – bromek etydyny i UV

-bufor do próbek – stabilizacja DNA, obciążnik i barwnik

-interpretacja wyników elektroforezy

-wizualizacja populacji cząsteczek o różnych wielkościach

-widzimy różnice w wielkościach i różnice w ilościach

-aby wyskalować potrzebujemy odnośników: marker wielkości i marker ilości

-analiza densytometryczna w komputerze

-jak uzyskiwać sztuczne cząsteczki DNA: mnożenie, cięcie i łączenie

-plazmidy

-operowanie na jednej cząsteczce DNA jest niemożliwe

-trzeba mieć mnóstwo identycznych cząsteczek

-najlepszy pomysł na mnożenie DNA to replikacja w bakteriach

-potrzeba sekwencji inicjacji replikacji i markera oporności – po to są wektory

-najczęściej stosowane wektory to plazmidy

-możemy łatwo namnożyć plazmid w bakteriach

-wprowadzenie do bakterii przez elektroporację

-selekcja na podłożu z antybiotykiem na który oporność niesie plazmid – pozbycie się bakterii bez plazmidu

-namnożenie w pożywce płynnej

-izolacja plazmidów

-procedura izolacji plazmidów

-jak odróżnić DNA od innych składników komórki

-jak odróżnić DNA plazmidowy od DNA genomowego bakterii?

-można wykorzystać superhelikalność plazmidu

-DNA silnie superhelikalny po denaturacji szybko renaturuje

-DNA mniej superhelikalny renaturuje bardzo powoli

-bakterie traktujemy roztworem o wysokim pH z dodatkiem detergentu – rozwala błony komórkowe, denaturuje DNA

-potem dodajemy octan amonu w dość dużym stężeniu – renaturuje DNA, wytrąca białka

-wirujemy – białka i DNA genomowy zostają w osadzie

-zatężenie i oczyszczenie przez wytrącanie etanolem

-mamy powielony plazmid, jeżeli była w nim jakaś sekwencja, która nas interesuje to mamy powieloną i tę sekwencję

-ale jak pozbyć się sekwencji pomocniczych?

-enzymy restrykcyjne

-odkryto enzymy, które rozpoznają motywy sekwencyjne i tylko w nich tną

-sekwencje rozpoznawane przez enzymy

-motywy najczęściej 4, 6 lub 8 par zasad

-sekwencje palindromiczne

-występują w genomie z różną częstością

-różnorodność enzymów restrykcyjnych (226 w katalogu NEB)

-dostępność i warunki trawienia

-lepkie i tępe końce

-system restrykcji i modyfikacji

-mapy restrykcyjne

-można dokonać charakterystyki cząsteczki np. plazmidu

-wyznaczenie gdzie ulokowane są miejsca restrykcyjne

-może dużo powiedzieć o cząsteczce

-łączenie cząsteczek DNA

-żeby budować cząsteczki DNA musimy umieć ciąć i łączyć

-ligacja – łączenie, enzym: ligaza

-zmieszanie dwóch cząsteczek i łączenie

-można połączyć dwie cząsteczki

-łączenie losowe

-można wstawiać wstawkę do plazmidu

-dzięki temu można namnożyć wstawkę w plazmidzie

-przecięcie plazmidu, dodanie wstawki, ligacja, transformacja

-jak pozbyć się plazmidów, które zamknęły się bez wstawki?

-trawienie dwoma enzymami z lepkimi końcami zarówno plazmidu jak i wstawki

-selekcja na białe i niebieskie

-plazmidy do klonowania genów

-specjalnie przygotowane

-oporność (amp, kan, chloramfenikol, inne)

-ori

-polilinker – miejsce z szeregiem unikalnych miejsc restrykcyjnych do wstawiania wstawek

-inne sekwencje pomocnicze (lacZ, fagowe, promotory T3 i T7)

-wybór plazmidów

-PCR

-skąd brać wstawki – nie zawsze można z plazmidu, synteza de novo niewykonalna

-kiedyś klonowano geny przez hybrydyzację kolonijną

-teraz dużo łatwiej przez PCR

-bardzo sprytny pomysł

-polimeraza DNA zaczyna syntezę od startera

-jeśli doda się dwa startery i polimerazę DNA – powstaną dwie cząsteczki potomne

-można to powtarzać i mieć wykładniczy przyrost liczby cząsteczek DNA, ale tylko tych między cząsteczkami

-jak zrobić, żeby primery za każdym razem siadały na swoich miejscach – ogrzewać do temperatury w której nici DNA się rozdzielają (denaturują) i potem ochładzać - renaturacja

-jak zrobić, żeby po każdym ogrzaniu polimeraza była obecna

-albo dodawać za każdym razem

-albo stosować polimerazę termostabilną wyizolowaną z bakterii żyjących w gorących źródłach

-polimeraza Taq – z Thermus aquaticus, bakterii żyjącej w gejzerach

-PCR w praktyce

-wybór starterów – muszą mieć właściwą temperaturę denaturacji i nie mogą być komplementarne same do siebie ani do nieodpowiednich obszarów w genomie

-matryca – DNA o odpowiednim stężeniu, teoretycznie wystarczy jedna cząsteczka, w praktyce lepiej mieć więcej

-nastawienie reakcji

-matryca

-startery

-dNTP

-bufor

-polimeraza Taq

-prowadzenie reakcji

-aparat do PCRu

-94º - denaturacja

-55º-70º - przyłączanie starterów

-72º - wydłuzanie

-powtórzone 25 do 40 razy

-rozdział w żelu

-ustalenie jakiej wielkości cząsteczki powstały i w jakich ilościach

-oczyszczenie