Andrzej Wierzbicki
konspekt wykładu z genetyki ogólnej
wykład 12 „Genetyka stosowana”
-PCR cd.
-zastosowania PCR
-klonowanie genów o znanej sekwencji
-znaczenie zsekwencjonowania genomów
-klonowanie genów o przypuszczalnej sekwencji (primery zaprojektowane na podstawie podobnej sekwencji lub na podstawie sekwencji białka)
-sprawdzanie obecności jakiejś sekwencji
-analiza ilościowa
-ilościowy RT-PCR histonów H1
-liście, łodygi, kwiaty, siewki 2d, siewki 7d, li. suszone
-hybrydyzacja
-rozpoznawanie DNA lub RNA dzięki zdolności do łączenia komplementarnych nici
-pozwala wykrywać i analizować interesującą nas sekwencję w masie innych
-zasada działania
-izolacja DNA lub RNA
-rozdział w żelu
-przeniesienie na membranę
-traktowanie wyznakowaną sondą
-detekcja sondy
-hybrydyzacja Southerna
-DNA trawiony enzymami restrykcyjnymi i rozdzielony w żelu
-wykrywanie cząsteczek o określonej sekwencji pozwala wykryć rearanżacje w genomie i liczbę kopii określonej sekwencji
-interpretacja wyników
-sprawdzanie liczby kopii transgenu
-jedno trawienie w obrębie transgenu
-drugie miejsce trawienia poza transgenem, w zasadzie odległość od transgenu losowa
-liczba prążków świadczy o liczbie kopii
-sprawdzanie rearanżacji genomu
-sonda komplementarna do sekwencji, która może ulec rearanżacji (transpozon, VDJ)
-przeniesienie transpozonu – zmiana wielkości prążka
-rekombinacja VDJ – zmiana wzoru prążków
-hybrydyzacja northern
-wykrywanie RNA
-ustalanie wielkości i ilości cząsteczek RNA
-interpretacja wyników
-można ustalić wielkość RNA i przez to wykrywać splicing
-można ustalić ilość RNA i przez to poziom ekspresji genu
-mikromacierze DNA
-odmiana hybrydyzacji
-wykrywanie naraz wielu tysięcy sekwencji
-badany DNA jest używany jako sonda, hybrydyzowany do płytki z naniesionymi kropelkami różnych DNA
-próbkę badaną znakujemy barwnikiem, a próbkę odniesienia znakujemy innym barwnikiem
-mierzymy proporcję kolorów – ona wyznacza poziom ekspresji
-można ustalić poziom ekspresji wszystkich genów
-inna odmiana macierzy – synteza oligonukleotydów metodą fotolitografii
-interpretacja wyników
-dla każdego genu umieszczonego ma mikromacierzy dostajemy wartość
-łatwo o błędy – każdy pyłek to pomyłka
-trudność w wyskalowaniu
-kontrole, powtórzenia i analiza statystyczna
-można badać wzór ekspresji genów w różnych warunkach i porównywać
-można wybierać pojedyncze geny do dalszej analizy
-można szukać podobieństw między wzorami ekspresji
-immunodetekcja białek
-białka też można rozdzielać w żelu
-żel poliakrylamidowy z SDS
-zamiast komplementarną sondą białka wykrywa się przeciwciałem
-przeciwciało uzyskuje się wstrzykując oczyszczone białko królikowi – w surowicy pojawia się sporo przeciwciała
-przeciwciała można wyznakować i w ten sposób wykrywać białka
-można oznaczać ilość białka
-poziom ekspresji
-obecność w różnych kompartmentach komórkowych lub ekstraktach
-można oznaczać zmiany w wielkości białka i modyfikacje posttranslacyjne
-genetyka hodowli roślin i zwierząt
-jak uzyskiwać najwydajniejsze rasy?
-znaczenie praktyczne i ogromne osiągnięcia
-początkowo robiono to sposobem intuicyjnym, potem zdecydowanie usystematyzowano
-dwa podstawowe podejścia
-hodowla czystych linii
-uzyskiwanie mieszańców
-hodowla czystych linii
-samozapylenie lub krzyżowanie wsobne
-wybór najlepszych i powielanie ich cech
-prowadzi do pełnej homozygotyczności
-uzyskuje się homogenną populację
-trzeba umieć wybrać punkt startu do hodowli czystych linii – ze zróżnicowanej populacji (kiedyś dzikiej, teraz krzyżówki między liniami)
-łączenie cech różnych linii
-krzyżowanie i śledzenie rodowodów
-krzyżowanie i robienie selekcji trochę na ślepo na polu
-krzyżowanie wsteczne – wprowadzenie jednej brakującej cechy do odmiany pod innymi względami optymalnej
-uzyskiwanie mieszańców
-krzyżówka dwóch osobników z różnych linii/odmian/ras daje potomstwo o dużo większym wigorze niż rodzicielskie
-po dalszych pokoleniach podwyższony wigor zanika
-heterozja – podłoże tego zjawiska jest nieznane
-podobnie może być z krzyżowaniem różnych gatunków, choć przeważnie potomstwo jest bezpłodne
-stosowane w praktyce
-wysiewa się F1 krzyżówki różnych odmian lub F2 krzyżówki 4 odmian
-muły – F1 krzyżówki osioł-koń
-organizmy modyfikowane genetycznie
-co to są OMG?
-zmodyfikowane przez celową interwencję w materiał genetyczny
-najczęściej wstawienie dodatkowych genów
-nie są OMG:
-interwencje niedziedziczne
-uzyskane w drodze hodowli
-uzyskane w drodze przypadkowej mutaganezy
-jak się uzyskuje OMG?
-etapy
-przygotowanie DNA
-wprowadzenie DNA
-integracja do genomu
-selekcja transformantów
-odtworzenie organizmu
-przygotowanie DNA
-musi zawierać sekwencje, którą chcemy wstawić plus różne sekwencje pomocnicze
-najczęściej wstawiamy gen kodujący jakieś białko plus odpowiedni promotor
-mogą być też sekwencje inicjujące RNAi
-znaczenie preferencji kodonów
-różne rodzaje promotorów
-konstytutywne
-tkankowo specyficzne
-indukowane
-znaczenie terminatora/sekwencji poliA
-sekwencje pomocnicze
-sekwencje pozwalające na utrzymywanie w bakteriach: ori i oporność bakteryjna zwykle są już na plazmidzie
-sekwencje pomagające przy wprowadzaniu DNA do komórek
-sekwencje pomagające przy integracji do genomu
-sekwencje niezbędne do selekcji transformantów
-strona techniczna
-sekwencje wyjściowe na plazmidach, a jeśli któraś nie to PCR
-trawienie enzymami restrykcyjnymi i ligacja
-wprowadzenie DNA
-jak spowodować, żeby DNA, który przygotowaliśmy znalazł się w środku w komórkach
-komórki bronią się przed połykaniem obcego DNA – błona komórkowa i ściana komórkowa
-metody bezpośrednie
-fizyczne wprowadzenie DNA
-elektroporacja
-mikroiniekcja
-strzelba genowa
-metody pośrednie
-skorzystanie z pomocy innych organizmów
-wirusy – do genomu wirusa wstawienie naszej sekwencji
-Agrobacterium
-bakteria zdolna do wprowadzania genów do komórek roślin
-normalnie żyje w glebie
-gdy w pobliżu jest uszkodzona roślina uruchamia mechanizm inwazji
-wnika do tkanki i wprowadza do komórek zestaw genów
-synteza opin lub nopalin – aminokwasów egzogennych
-synteza hormonów roslinnych powodujących niekontrolowany rozrost zainfekowanych komórek
-powstaje narośl, która produkuje aminokwasy będące pożywieniem tylko dla Agrobacterium
-wprowadzane geny są na plazmidzie, wprowadzany jest tylko T-DNA
-oprócz T-DNA muszą być na plazmidzie geny odpowiedzialne za transfer do komórek roślinnych (geny vir)
-do naszych celów usuwamy wszystko z T-DNA i wstawiamy tam nasze sekwencje
-zestawy plazmidów do transformacji
-integracja do genomu
-jest niezbędna aby modyfikacja była dziedziczna
-czasami nie jest niezbędna, gdy chcemy uzyskać ekspresję przejściową
-najprostsza forma to wstawienie do plazmidu – wtedy wprowadza się cały plazmid (tylko bakterie i grzyby)
-integracja najczęściej zachodzi w sposób losowy, mechanizm jest słabo zrozumiany
-tak jest przy strzelbie genowej i Agrobacterium
-integracja może być ukierunkowana
-przez rekombinację umiejscowioną – rekombinaza Cre, musi być miejsce cre w genomie
-integracja przez rekombinację homologiczną
-pozwala wstawić idealnie we właściwe miejsce w genomie
-za kierowanie odpowiadają fragmenty transgenu homologiczne do genomu
-rekombinacja powoduje usunięcie fragmentu sekwencji genomowej i wstawienie na to miejsce transgenu
-możemy umieścić poza miejscami homologii gen wrażliwości na jakąś substancję – pozbycie się integracji niehomologicznych
-znaczenie miejsca integracji
-obszary o różnej strukturze chromatyny nadają różny poziom ekspresji transgenu
-gdy integracja jest losowa, poziom ekspresji z transgenu też może być losowy
-stosując rekombinację homologiczną można kontrolować efekt pozycyjny
-selekcja transformantów
-nie sposób zmodyfikować genetycznie wszystkich komórek organizmu
-modyfikacji ulega niewielka część, a niezmodyfikowanych trzeba się pozbyć
-najczęściej robi się to przez wprowadzanie na transgenie genu oporności na antybiotyk – nie transgeniczne zdychają
-czasem nie można wprowadzić oporności – wtedy selekcja przez detekcję genu reporterowego lub sprawdzanie transgeniczności
-odtworzenie organizmu
-modyfikacji ulegają pojedyncze komórki
-trzeba z jednej komórki odtworzyć cały organizm
-w przypadku roślin proste – regeneracja z kallusa lub embriogeneza somatyczna
-u zwierząt wszczepienie do zarodka lub transfer jąder komórkowych
-transformacja linii płciowej – technika in planta
-zastosowania OMG
-ustalanie funkcji genu
-manipulacje na genach i obserwowanie skutków
-usunąć i patrzeć co będzie, dodać więcej i patrzeć co będzie
-usunięcie
-knock-out
-rekombinacja homologiczna
-specyficzne usunięcie genu
-wykazanie funkcji telomerazy w wydłużaniu telomerów
-dodanie więcej
-nadekspresja cykliny D
-rośliny rosną większe
-wykazanie funkcji cykliny w regulacji intensywności podziałów komórkowych
-szereg innych zastosowań badawczych
-produkcja cennych białek
-niektóre białka są przydatne, ale trudno je uzyskać z naturalnych źródeł
-można produkować w ogromnych ilościach w organizmach transgenicznych
-ekspresja w bakteriach (insulina)
-ekspresja w innych organizmach
-uzyskanie prawidłowych białek eukariotycznych
-cały szereg różnych białek w roślinach i mleku zwierząt
-zwiększenie wydajności w rolnictwie
-nadanie oporności na szkodniki
-ekspresja toksyny Bacillus turingensis w roślinach
-była od lat używana jako pestycyd tradycyjny
-toksyczna jest tylko w stanie rozpuszczonym – rozpuszcza się wyłącznie w wysokim pH, a takie jest wyłącznie w przewodach pokarmowych niektórych owadów
-nadanie oporności na herbicyd
-można pola opryskiwać tym herbicydem i zabijać wszystkie chwasty
-system z opornością na Roundup
-poprawianie składu
-poprawianie właściwości roślin lub zwierząt w rolnictwie
-bardzo rozwojowy kierunek – ile ziarna, ile słomy, kaktusy
-poprawa charakterystyki mleka
-krowy z wprowadzonymi genami kodującymi b- i k- kazeinę
-powoduje, że łatwiej robi się sery i więcej wapnia
-ryby z dodatkowym genem hormonu wzrostu
-zwiększona produkcja hormonu wzrostu
-przyrost wagi nawet 10x szybszy
-co ciekawe – na odmiany dzikie wpływ ogromny, na odmiany hodowlane wpływ niewielki
-usuwanie zanieczyszczeń z gleby
-dotychczas oczyszczanie gleby silnie zanieczyszczonej metalami ciężkimi, zanieczyszczeniami organicznymi – zdarcie gleby i wypalanie w piecach
-rośliny mają predyspozycje do usuwania zanieczyszczeń z gleby – można je jeszcze poprawić i do tego zastosować
-usuwanie rtęci
-w glebie w toksycznej formie Hg2+ lub organiczne związki rtęci
-tulipanowiec (drzewo) lub Arabidopsis z genami kodującymi białka rozkładające organiczne związki rtęci i redukującymi rtęć do formy metalicznej
-uzyskały odporność na rtęć i zdolność do unieszkodliwiania
-drugie zastosowanie - usuwanie materiałów wybuchowych
-zanieczyszczenie może dochodzić do 200g/kg na poligonach i przy fabrykach - grozi wybuchem
-tytoń z wprowadzonym bakteryjnym genem kodującym enzym rozkładający trotyl i nitroglicerynę
-rozkłada i unieszkodliwia
-zagrożenia związane ze stosowaniem omg
-toksyczność
-co do zasady omg nie są toksyczne przez sam fakt modyfikacji
-toksyczność może wystąpić tylko gdy wprowadziliśmy toksyczny gen (Bt)
-odniesienie toksyczności omg do toksyczności pestycydów
-niekontrolowane rozprzestrzenienie
-nadanie cechy dającej dużą przewagę w środowisku może powodować rozprzestrzenienie niektórych organizmów
-analogia do królików w Australii i moczarki kanadyjskiej w Europie
-znaczenie poziomu wyspecjalizowania odmian hodowlanych i ich braku przystosowania do wzrostu poza polem uprawnym
-niebezpieczeństwo przemieszania się nasion transgenicznych i nietransgenicznych
-transfer genów
-geny nadające cechy dające przewagę w środowisku mogą przeniknąć do dzikich krewnych i powodować, że zamienią się w superchwasty
-wiele gatunków hodowlanych ma dzikich krewniaków z którymi czasami się krzyżują
-zwiększanie bezpieczeństwa omg
-organizmy modyfikowane genetycznie wzbudzają wielkie emocje
-z jednej strony zaangażowanie firm biotechnologicznych dbających o rozwój rynku, ale napędzających rozwój rolnictwa
-z drugiej strony prężne organizacje tak zwane ekologiczne – bazujące na obawach przed nowym i często działające histerycznie, ale czasem wykazujące dużą wyobraźnie w przewidywaniu niebezpieczeństw
-zachowanie szczególnej ostrożności
-uniknięcie problemów wywołanych przez głupotę
-zapobieganie tworzeniu transgenicznego pyłku
-transgen w chloroplastach
-nie przenosi się przez pyłek i dzięki temu nie przeniesie się na dużą odległość
-z genem oporności na herbicyd połączony jest gen zabijający pyłek
-po opryskaniu herbicydem przeżywają tylko rośliny męskosterylne
-10% rzepaku w Kanadzie
-uniemożliwienie tworzenia nasion
-gen toksyczny dla nasion inaktywowany
-nasiona powstają, producent nasion hoduje bez przeszkód u siebie
-nasiona przed sprzedażą poddawane są aktywacji
-u rolnika roślina wyrasta, ale nie wydaje nasion
-wykorzystanie rekombinacji homologicznej