Andrzej Wierzbicki
konspekt wykładu z genetyki ogólnej
wykład 3 „Jaka jest natura genów”
Analiza statystyczna wyników krzyżówek – test chi-kwadrat
-sprawdzenie czy wynik jest zgodny z zakładanym rozkładem
-jak biolodzy robią analizę statystyczną
-hipoteza zerowa: uzyskane dane nie odbiegają znacząco od założonego rozkładu
-współczynnik chi-kwadrat
-odczytanie istotności statystycznej z tabeli
-prawdopodobieństwo, że wynik odbiega od rozkładu przez przypadek
-mała wartość chi-kwadrat , nie odbiega od założonego rozkładu
-duża wartość chi-kwadrat – odbiega od założonego rozkładu
-stopnie swobody – liczba niezależnych zmiennych
-sprawdzenie istotności statystycznej wyników Mendla
-6022/2001
-wynik nie odbiega od rozkładu 3:1 – odstępstwo jest przypadkowe
-gdyby było 4552/3471 to by znacząco odbiegał – odstępstwo nieprzypadkowe
-sprawdzenie czy wyniki z zadania o kukurydzy pasują do przewidzianego rozkładu
-9:3:3
-chi-kwadrat 0,37 – nie odbiega, odstępstwo przypadkowe
-mogliśmy wyciągnąć wniosek jak wtedy
-ustalenie sprzężenia i odległości między genami – krzyżówka cP/Cp x cp/cp
-krzyżówka wsteczna
-czy geny są sprzężone, czy odchylenie od rozkładu jest przez przypadek?
-P < 0,001 – odstępstwo nie jest przez przypadek, są sprzężone
-11% rekombinantów – 11 cM
-znamy odległość między genami i zależność między nimi (5 cM, spełniają tę samą funkcję)
-ile roślin wysiać aby otrzymać 10 roślin białych?
-jeśli jest choć jeden jest allel dominujący – czerwone, aabb białe
-rozpiska gamet
-częstość gamet wyliczona z częstości rekombinacji
-ab występuje z 2,5%
-aabb – 2,5% * 2,5% = 0,000625
-10/0,000625 = 16000 nasion trzeba wysiać
Jaka jest fizyczna natura genów?
-dotychczasowa droga zrozumienia natury dziedziczności
-informacja dziedziczna ma naturę dyskretną
-cechy dziedziczą się zgodnie z prawami Mendla
-geny są na chromosomach (sprzężenie i rekombinacja)
-czym dokładnie są te geny?
-musi być osobna materia dziedziczna – cechy są przekazywane przez komórki płciowe, które nie mają cech dojrzałego organizmu
-droga od chromosomów do cząsteczki chemicznej
-mutacje to fizyczne zmiany w genach
-mutacje pojawiają się bardzo rzadko
-Morgan długo szukał
-JH Muller – promienie X indukują mutacje
-ogromnie znaczenie praktyczne
-mutageneza
-zrozumienie zagrożeń związanych z promieniowaniem
-pokazało jednoznacznie, że geny są w cząsteczkach chemicznych, które ulegają uszkodzeniu przez promieniowanie
-geny są zapisane w jakiejś substancji chemicznej
-obecna w jądrze komórkowym i chromosomach
-wystarczająco złożona, żeby zawierać w sobie mnóstwo informacji
-substancje nieorganiczne i proste organiczne odpadają
-wchodzą w grę białka i kwasy nukleinowe
-co jest nośnikiem genów (DNA jest czynnikiem transformującym Pneumococcus)
-Pneumococcus – bakteria wywołująca zapalenie płuc u ssaków
-transformacja Pneumococcus – wykorzystując to zjawisko ustalono, w jakiej substancji chemicznej są geny
-różne szczepy:
-I, II, III etc. szczepy o różnych antygenach powierzchniowych
-patogenne (S) duże komórki, wytwarzają otoczkę śluzową chroniącą przed układem odpornościowym
-niepatogenne (R) mutanty pozbawione otoczki śluzowej, niezdolne do wywoływania choroby
-S mutuje w R i bardzo rzadko zachodzą rewersje R do S
-nigdy nie zachodzi zmiana typu I na II etc.
-sprawdzenie, jaka substancja chemiczna transformuje
-zabicie bakterii IIIS
-chemiczne oczyszczenie polisacharydów, białek i DNA
-mieszanie ze szczepem IIR
-tylko DNA transformuje IIR do IIIS
-a więc geny są w DNA
-w 1944 roku przyjęto to ze sceptycyzmem, dopiero następny eksperyment przekonał wszystkich
-fag T2 – wirus atakujący Esherichia coli
-składa się z DNA i otoczki białkowej
-wyznakowanie DNA 32P i otoczki białkowej 35S
-P w DNA dużo, w białkach prawie nie ma
-S w białkach dużo, w DNA nie ma
-hodowla na radioaktywnym źródle
-zakażenie bakterii wyznakowanymi fagami
-adsoprcja na bakteriach (widoczna pod ME)
-homogenizacja – otoczki białkowe odpadają od bakterii, 35S uwalnia się do pożywki
-32P pozostaje w bakteriach – DNA został wprowadzony do bakterii
-fagi replikują i uwalniają się z bakterii
-tylko DNA jest niezbędny do replikacji faga
-materiał genetyczny faga jest w DNA
-dlaczego ten eksperyment wszystkich przekonał?
-genetyka fagów była intensywnie badana od pewnego czasu i były uznane za wiarygodny model badawczy
-pokazano mutagenezę i rekombinację – identyczną jak w wyżaszych organizmach
-od 1944 do 1952 roku wykazano, że struktura DNA jest wystarczająco złożona aby kodować informację genetyczną
-co robią geny? (geny kodują białka)
-pierwszy pomysł – alkaptonuria
-Archibald Garrod 1902, angielski lekarz
-choroba genetyczna człowieka
-ciemne zabarwienie moczu, nadmiar pewnej substancji (homogenistic acid)
-w tym czasie odkryto enzymy
-hipoteza, że pacjenci mają mutację w genie kodującym enzym rozkładający tę substancję
-gen koduje enzym, gen koduje białko
-hipoteza wyprzedziła epokę o 40 lat
-genetyka Neurospora (hipoteza jeden gen-jeden enzym)
-grzyb bardzo dogodny w hodowli
-łatwo prowadzić mutagenezę i znajdywać mutanty niezdolne do wzrostu bez jakiejś substancji (auksotrofy)
-rosną w pożywce pełnej
-nie rosną w pożywce minimalnej
-rosną w pożywce minimalnej + coś
-przez większość życia haploidalna – genotyp = fenotyp
-tworzy heterokarion
-grzybnia z dwoma rodzajami jąder komórkowych
-zachowuje się jak diploid
-można robić testy komplementacji
-różne geny – rośnie
-jeden gen – nie rośnie
-wyizolowano szereg auksotrofów niezdolnych do wzrostu bez argininy
-analiza komplementacji -> trzy grupy komplementacji, trzy geny
-wiadomo, że arginina powstaje z cytruliny, cytrulina z ornityny, ornityna z prekursora
-mutant 1 (arg-e) rośnie na cytrulinie, ornitynie i argininie – mutacja w genie kodującym enzym zamieniający prekursor w ornitynę
-mutant 2 (arg-f) rośnie na cytrulinie i argininie, nie rośnie na ornitynie – mutacja w genie kodującym enzym zamieniający ornitynę w cytrulinę
-mutant 3 (arg-g) rośnie na argininie, nie rośnie na cytrulinie ani ornitynie - mutacja w genie kodującym enzym zamieniający cytrulinę w argininę
-anemia sierpowata
-choroba genetyczna – anemia i odporność na malarię
-Pauling (1949): mutacja powoduje zmianę struktury jednego białak – hemoglobiny
-jeden gen – jedno białko, mutacje powodują zmiany w sekwencji białek
-później opisano szereg mutacji w hemoglobinie
-Linus Pauling – słynny biochemik/biofizyk, ustalił pierwszą strukturę białka (hemoglobiny), Nobel z chemii i pokojowy za protesty przeciwko próbom jądrowym (syndrom naukowców w służbie „pokoju” – Nirenberg i SDI)
-struktura DNA
-DNA koduje geny, ale jak?
-poznanie struktury – klucz do zrozumienia sposobu funkcjonowania DNA i mechanizmu chemicznego będącego podłożem dziedziczności
-dostępność metod krystalograficznych – dyfrakcja promieni X
-ustalenie struktury białek
-co było wiadomo o DNA
-polimer złożony z cząsteczek deoksyrybozy, reszt fosforanowych i zasad azotowych (purynowych i pirymidynowych)
-grupa fosforanowa jest połączona z rybozą, a ta łączy się z zasadą azotową
-zasada plus ryboza to nukleozyd
-nukleozyd plus grupa fosforanowa to nukleotyd
-grupy fosforanowe przyłączone są do węgli 5’ i 3’ deoksyrybozy, naprzemiennie występujące grupy fosforanowe i deoksyrybozy tworzą szkielet cząsteczki
-zasady azotowe są przyłączone do węgla 1’ deoksyrybozy i odstają na bok
-pytanie: jak to wszystko układa się w przestrzeni?
-Watson i Crick zaproponowali wyjaśnienie
-zgodne z dostepnymi danymi
-atomy mieszczą się w przestrzeni
-struktura wyjaśniła funcję
-przesłanki, które doprowadziły Watsona i Cricka do struktury DNA
-proporcje AT i GC są stałe
-cząsteczka ma układ helikalny i składa się z więcej niż jednego łańcucha polinukleotydowego
-struktura jest stanilizowana przez wiązania wodorowe
-cząsteczka DNA składa się z dwóch nici polinukleotydowych, układ antyrównoległy
-nici oddziałują ze sobą przez wiązania wodorowe między zasadami azotowymi
-adenina oddziałuje z tyminą, guanina z cytozyną
-nici są zawsze do siebie komplementarne
-implikacje modelu Watsona-Cricka
-informacja genetyczna jest zakodowana w sekwencji DNA
-replikacja informacji genetycznej polega na tworzeniu nowej nici na matrycy starej nici
-zmiana nukleotydu na inny (promieniowanie, błąd replikacji) powoduje mutację
-model Watsona-Cricka – przełomowy moment w biologii, od niego zaczęła się nowa era
-mechanizm wszystkich podstawowych procesów życiowych został zrozumiany
-procesy związane z DNA zostały albo przewidziane przez model, albo szybko odkryte
-procesy biochemiczne, fizjologiczne i rozwojowe – gwałtowne przyśpieszenie badań dzięki wykorzystaniu manipulacji DNA
-przebieg odkrycia struktury DNA
-zrozumiano, że DNA jest bardzo ciekawy – wiele zespołów próbowało rozpracować jego strukturę i sposób funkcjonowania
-Pauling wymyślił potrójną helisę – błędny model, nie miał wystarczająco danych
-Watson i Crick: wzięli pod uwagę dostępne wiarygodne dane, użyli zdrowego rozsądku i mieli dostęp do wyników dyfrakcji promieni X na kryształach DNA
-współpracowali z Mauricem Wilkinsem i Rosalind Franklin – fizykami, którzy umieli robić dyfrakcję promieni X
-mieli dostęp do ich danych – to był brakujący klocek układanki – więcej niż jedna nić, helisa, informacje ilościowe – zmieszczenie w przestrzeni
-Paulingowi odmówiono dostępu do tych danych
-dlaczego Wilkins ani Franklin tego sami nie wymyślili?
-Rosalind Franklin – czy przykład antyfeminizmu w nauce?
-25 lipca 1953 – trzy artykuły w Nature: Watson i Crick, Wilkins, Franklin
-Watson i Crick – model ale bez żadnych popierających go wyników
-Wilkins i Franklin – wyniki, ale bez modelu
-kto zachował się prawidłowo i odpowiedzialnie jako naukowiec?
-model Watsona i Cricka – teoria wymagająca szeregu eksperymentów do potwierdzenia
-potwierdzenie implikacji struktury DNA Watsona-Cricka
-Geny mają strukturę liniową
-jeśli są zakodowane w sekwencji DNA, nie mogą być dyskretne
-badania na fagu T4
-bardzo szybki cykl życiowy
-łatwo je liczyć – hoduje się szalkę z bakteriami, wysiewa się fagi i liczy łysinki
-mutanty rII – łatwo otrzymywać przez mutagenezę i selekcjonować na szalkach
-większe łysinki
-w szczepie E. coli K(l) nie robią łysinek (bakteria od razu zdycha)
-można naprodukować dużo faga rII, wysiać na bakterie K(l) i każda łysinka to będzie rewersja – zniknięcie mutacji
-mierzenie rekombinacji w obrębie genu
-zmieszanie dwóch szczepów faga – mutanty w tym samym genie
-namnożenie w bakteriach dzikich
-zakażenie bakterii K(l)
-liczenie łysinek – każda łysinka to rekombinant
-fagi rekombinują w bakteriach
-jeśli to były mutanty w tym samym genie, to obserwujemy rekombinację wewnątrz genu
-potwierdzenie, że geny nie mają natury dyskretnej
-mapa genetyczna różnych mutacji
-procent rekombinantów – odległość na mapie
-odległości się sumują – mapa wiarygodna
-jeśli gen jest w sekwencji nukleotydów to mapa powinna mieć rozdzielczość ograniczoną do jednego nukleotydu
-maksymalna rozdzielczość mapy – 0,002, tyle łysinek da się policzyć
-minimalna obserwowana rozdzielczość – 0,02
-odpowiada mniej więcej jednemu nukleotydowi w sekwencji
-ciekawa klasa mutacji
-nie rekombinują z niektórymi innymi mutacjami
-powodują, że odległość między innymi mutacjami się zmienia
-delecje
-potrójne potwierdzenie, że geny są zakodowane w czymś długim i złożonym z kawałków – pasuje idealnie do DNA – potwierdzenie pierwszej przesłanki Watsona i Cricka, ale nie dowód
-mutacje to zmiany w sekwencji DNA
-było niemożliwe do sprawdzenia – nie umiano sekwencjonować DNA (dopiero w 1975 opracowano metodę sekwencjonowania)
-ograniczenie metodyczne kazało iść okrężną drogą
-semikonserwatywna replikacja DNA
-kolejna przesłanka wynikająca z modelu Watsona i Cricka
-cząsteczka DNA rozdziela się na dwie nici i w każdej druga nić jest dobudowywana
-alternatywne modele
-konserwatywna – na bazie jednej dwuniciowej tworzona jest druga dwuniciowa
-„rozdzielna” – fragmenty obu nici są losowo rozdzielane do nici potomnych
-badania z użyciem ciężkiego izotopu azotu
-hodowla bakterii w 15N – cały DNA zbydowany jest z 15N
-DNA z 15N da się odróżnić od DNA z 14N – wirowanie w gradiencie CsCl; cięższy 15N osadza się niżej
-bakterie hodowano w 15N – cały DNA ma wbudowany 15N, osadza się niżej
-przeniesiono do 14N
-po czasie odpowiadającym jednemu podziałowi – cały DNA osadza się w połowie drogi – zbudowany pół na pół z 14N i 15N
-po czasie odpowiadającym dwóm podziałom – 50% 14N, 50% pośredniego
-po 3 podziałach – 75% 14N, 25% pośredniego
-interpretacja
-nici DNA się rozdzielają i dobudowywana jest druga z 14N
-w kolejnym pokoleniu analogicznie – pół ma tylko 14N, pół ma mieszany
-dalej ¼ ma mieszany, ¾ ma tylko 14N
-potwierdzenie replikacji semikonserwatywnej – potwierdzenie wniosku Watsona i Cricka