Andrzej Wierzbicki
konspekt wykładu z genetyki ogólnej
wykład 4 „Jak działają geny”
Jak działają geny
-wiemy, że
-geny są zapisane w sekwencji nukleotydów w DNA
-geny w jakiś sposób kodują białka
-jakie powstaje pytanie
-jak sekwencja DNA wpływa na strukturę białka?
-droga od DNA do białek
-białka
-cząsteczki chemiczne występujące w dużych ilościach w organizmach żywych
-zbudowane z 20 aminokwasów w różnych kombinacjach
-funkcje strukturalne i enzymatyczne
-ogromna różnorodność białek – potrzeba mnóstwo informacji aby określić wszystkie białka
-mutacje powodują zmiany pojedynczych aminokwasów w białkach
-mutacja w hemoglobinie – anemia sierpowata
-zamiana glutaminianu na walinę w pozycji 6
-inne mutacje w hemoglobinie wywołujące anemie – inne zmiany w sekwencji białka
-pierwsza przesłanka, że sekwencja DNA może określać sekwencję białka
-kolinearność mapy genetycznej i sekwencji białka
-uzyskanie wielu mutantów trpA E.coli
-zmapowanie wielu mutacji w obrębie genu
-sekwencjonowanie produktów białkowych
-okazało się, że mutacje i zmiany w sekwencji białka występują w tej samej kolejności
-potwierdza, że sekwencja białka musi być zapisana w sekwencji DNA
-czemu tak pokrętne metody – nie umiano sekwencjonować DNA
-jak sekwencja DNA koduje sekwencję aminokwasów w białkach?
-rozważania teoretyczne Gamowa
-ile liter musi mieć słowo kodu?
-4 nukleotydy – 20 aminokwasów
-1 litera – 4 kombinacje
-2 litery – 16 kombinacji
-3 litery – 64 kombinacji
-4 litery – 256 kombinacji
-najmniejsza wystarczająca liczba – 3 - najprawdopodobniejsza
-co się dzieje z nadmiarem? (niektóre nieużywane czy redundancja)
-czy kod genetyczny ma przecinki?
-jedna z zasad byłaby przecinkiem (spacją) oddzielającą słowa kodu od siebie
-do kodowania używane byłyby trzy pozostałe wystarczająca liczba
-bez przecinków możliwe trzy ramki odczytu
-wyznaczane przez miejsce startu
-spory nadmiar kodonów
-wrażliwość na insercje i delecje
-czy kod genetyczny jest zachodzący?
-czy słowa zachodzą na siebie?
-jeśli zachodzą o dwa nukleotydy – po danym kodonie mogą być tylko cztery inne, jeśli o jeden – 16 innych
-obok danego aminokwasu nie mógłby wystąpić dowolny inny
-gdy kod nie zachodzący – obok danego aminokwasu może być aminokwas dowolny
-Francis Crick i Sidney Brenner znaleźli odpowiedzi na te pytania
-czy jest zachodzący?
-sprawdzali, czy obok danego aminokwasu może być dowolny inny
-udowodnili, że może – kod nie jest zachodzący
-jak to udowodnić?
-proteazy trawiące specyficzne sekwencje – trypsyna po lizynie lub argininie
-odcięcie hydrolityczne pierwszego aminokwasu
-chromatografia – jeśli jest 20 pików – kod niezachodzący
-czy ma przecinki?
-użyli proflawin – substancje podobne kształtem do zasad purynowych i pirymidynowych
-interkalują w DNA – powodują insercje i delecje o jedną zasadę
-dwie klasy mutacji w genie rII faga T4
-mutant klasy 1 i mutant klasy 2 mają zmieniony fenotyp (duże łysinki)
-podwójne mutanty 1, 1 i 2, 2 też mają zmieniony fenotyp
-podwójny mutant 1, 2 ma normalny fenotyp
-interpretacja – to są mutacje zmiany ramki odczytu
-klasa 1 – delecje, klasa 2 – insercje
-wszystkie aminokwasy po mutacji są nieprawidłowe
-podwójny mutant dwie delecje lub dwie insercje – też wszystkie potem są nieprawidłowe
-podwójny mutant delecja, insercja – błąd tylko niewielki, dalsze aminokwasy są dobre
-istnienie mutacji zmiany ramki odczytu dowodzi braku przecinków
-ile liter ma słowo kodu?
-jeżeli będzie blisko siebie tyle delecji ile liter ma słowo kodu – powinien wypaść jeden aminokwas, ale może to białku nie zaszkodzić
-jedna delecja – fenotyp zmieniony
-dwie delecje – fenotyp zmieniony
-trzy delecje – fenotyp normalny
-cztery delecje – fenotyp zmieniony
-dowód na trójkowość kodu genetycznego
-jakie kombinacje zasad kodują które aminokwasy?
-wprowadzić DNA o znanej sekwencji i patrzeć jakie białko powstanie
-technicznie niemożliwe
-między DNA a białkiem jest pośrednik – dopiero odkrycie tego pośrednika pozwoliło złamać kod genetyczny
-przepływ informacji od DNA do białek
-połączenie nie jest bezpośrednie
-DNA jest w jądrze komórkowym, białka są syntetyzowane w zytoplazmie
-na matrycy DNA powstaje RNA, na matrycy RNA powstaje białko
-jednokierunkowy przepływ informacji
-pierwszy wpadł na to Crick (ten od Watsona) – centralny dogmat biologii molekularnej
-czy słowo dogmat pasuje do hipotez biologicznych?
-pośrednikiem jest RNA
-kwas nukleinowy podobny do DNA
-zamiast deoksyrybozy jest ryboza
-zamiast tyminy jest uracyl
-nietrwały
-złamanie kodu genetycznego
-wykorzystano dwie umiejętności
-system in vitro – zlizowane komórki E.coli, mające większość aktywności enzymatycznych, można do nich dolewać co się chce
-synteza RNA o w miarę określonej sekwencji
-mierzenie syntezy białka – włącznie do pilipeptydów znakowanych aminokwasów
-synteza polinukleotydów – polipeptydy z jednym aminokwasem
-wiadomo co kodują trójki UUU,AAA etc.
-Nirenberg, UUU-Phe ogłosił na konferencji w Moskwie, zadzwonił jego współpracownik, że CCC koduje Pro
-synteza poli di-, tri-, tetranukleotydów
-rozpracowanie wszystkich trójek
-później jednoznacznie udowodniono stosując bardziej zaawansowane metody
-kod genetyczny
-tabela kodu genetycznego
-większość aminokwasów ma dwa do sześciu kodonów (degeneracja)
-tylko Trp i Met mają po jednym kodonie
-są trzy kodony stop
-rolę kodonu start pełni metionina
-ostatnia litera kodonu często nie niesie informacji
-jeśli niesie, to najczęściej gro rolę czy jest tam puryna czy pirymidyna
-preferencja kodonów w różnych organizmach
-różne kodony kodujące ten sam aminokwas występują z różną częstością u różnych organizmów
-wynika z przypadku
-aparat biosyntezy białek jest do tego przystosowany
-złe użycie kodonów uniemożliwia produkcję białka w większej ilości
-różnica między E.coli a człowiekiem
-przeniesienie genu ludzkiego do E.coli (np. produkcja insuliny) wymaga zmiany wykorzystania kodonów
-uniwersalność kodu genetycznego
-kod genetyczny jest uniwersalny – u praktycznie wszystkich organizmów jest taki sam
-duże znaczenie w biotechnologii – łatwość przenoszenia genów
-argument za monofiletycznością życia
-drobne odstępstwa – głównie w mitochondriach i u dziwnych pierwotniaków lub bakterii
-zmiany kodu genetycznego można łatwo prześledzić w ewolucji – często stosowana metoda
-kod genetyczny
-sposób w jaki sekwencja białka jest zapisana w sekwencji DNA
(kod to nie sekwencja!)
-trójkowy, bezprzecinkowy, nie zachodzący, zdegenerowany, uniwersalny
-białka
-dlaczego białka są takie ważne?
-spełniają dużo różnych funkcji
-DNA ma rolę informacyjną, białka spełniają przeróżne funkcje
-DNA – przepis, białko – ciasto
-enzymy – życie to ciąg reakcji chemicznych, prawie wszystkie są katalizowane przez różne enzymy
-sygnalizacja – detektory substancji informacyjnych (hormonów i neurotransmiterów)
-transportowa – transport tlenu, żelaza, lipidów itd.
-magazynowa – magazynowanie żelaza, jodu itd., magazyny substancji odżywczych w mleku, jajach itd.
-strukturalna – cytoszkielet, skóra, kości, włosy
-motoryczna – aktyna i miozyna w mięśniach
-odpornościowa – przeciwciała rozpoznające wirusy i bakterie
-białka – bezpośredni wykonawcy większości czynności życiowych
-co określa funkcję białka?
-struktura białka określa funkcję
-wgłębienie do którego pasuje substrat – enzym
-wydłużone cząsteczki – kolagen
-miejsca na wiązanie hemu – hemoglobina
-inne struktury
-co określa strukturę białka?
-sekwencja aminokwasowa
-czy jest coś jeszcze co daje białku informację jaką strukturę ma przyjąć
-eksperyment Anfinsena
-struktura białka jest stabilizownana przez mostki dwusiarczkowe
-denaturacja – zniekształcenie struktury białka (pod wpływem temperatury lub substancji chemicznych)
-zniszczył mostki, zdenaturował białko 8M mocznikiem, renaturował usuwając mocznik, odtworzył mostki dwusiarczkowe
-białko odzyskało aktywność (RNaza)
-kontrola: najpierw odtworzył mostki, potem zrenaturował – brak aktywności
-dowód, że do przyjęcia danej struktury wystarczy tylko sekwencja
-poziomy struktury białek
-pierwszorzędowa
-sekwencja
-orientacja: N-koniec i C-koniec (5’ – 3’)
-zwykle 100 – 1500 aminokwasów
-drugorzędowa
-polipeptydy tworzą regularne układy
-alfa helisy i beta harmonijki
-obejmują tylko drobną część białka
-trzeciorzędowa
-wzajemny układ struktur drugorzędowych
-najczęściej tak określamy strukturę całego białka
-czwartorzędowa
-wzajemne ułożenie wielu polipepetydów w białku złożonym
-hemoglobina składa się z 4 polipeptydów
-budowa modularna białek
-białka często składają się z modułów strukturalnych
-wyodrębnione sekwencyjnie i strukturalnie
-pełnią niezależne funkcje będące częściami składowymi funkcji całego białka
-domeny transbłonowe, katalityczne, regulacyjne, oddziaływań
-HLA i Rubisco
-znaczenie białek opiekuńczych
-specjalne białka pomagają przyjąć właściwą strukturę trzeciorzędową
-mają kształt baryłki (bakteryjny GroEL)
-kosztem energii z ATP
-białka czaperonowe mają szczególne znaczenie w podwyższonej temperaturze (stąd nazwa HSP)
-przewidywanie struktury trzeciorzędowej białek
-fałdowanie białek – proces o naturze dość prostej
-minimalizacja energii swobodnej
-hydrofobowe fragmenty tworzą rdzeń, hydrofilowe na zewnątrz
-stabilizacja przez mostki dwusiarczkowe, wiązania wodorowe itd.
-zależy głównie od parametrów chemicznych cytoplazmy i białek czaperonowych
-zasymulować nie sposób
-można zgadywać na podstawie białka o podobnej sekwencji i znanej strukturze
-gdy tego brakuje zostają tylko domysły
-łatwiej przewidzieć struktury drugorzedowe (ograniczone znaczenie dla zgadywania funkcji) i domeny (bardzo przydatne)
Prace naukowe
-jak powstaje nowa wiedza?
-eksperymenty i obserwacje
-ktoś prowadzi i jeśli odkrywa coś nowego, to opisuje
-opis jest publikowany w czasopismach naukowych – publikacja
-elementy publikacji naukowej
-wstęp – opis stanu wiedzy przed badaniami
-metody – opis zastosowanych metod pozwalający na powtórzenie badań
-wyniki – opis dokonanych odkryć
-dyskusja – opis stanu wiedzy po przeprowadzeniu badań
-streszczenie
-spis literatury
-jak wygląda droga artykułu od napisania do druku
-przeprowadzenie i udokumentowanie eksperymentów
-napisanie tekstu artykułu
-wybór czasopisma w którym ma się ukazać
-pisma najwyższego kalibru – Nature, Science – większość dziedzin, tylko artykuły o ogólnym znaczeniu, również dla niespecjalistów
-najlepsze pisma branżowe – Cell, Lancet, Physical Review Letters, Genes and Development – dla specjalistów, ale publikujące tylko najciekawsze i najlepiej udokumentowane prace
-solidne pisma branżowe – EMBO J, Development,
Plant Cell etc
-pisma najsłabsze
-o tym gdzie praca się ukaże decyduje to jak jest ciekawa i przekonująca
-wysłanie do redakcji
-redaktor (najczęściej to dobry naukowiec) czyta i jeśli brzmi mu obiecująco to wysyła do recenzentów
-dwaj dobrzy specjaliści z dziedziny
-anonimowi
-czytają i oceniają
-na podstawie recenzji zapada werdykt: odrzucenie, zwrot do poprawek, przyjęcie
-po przyjęciu często publikacja w internecie