Andrzej Wierzbicki
konspekt wykładu z genetyki ogólnej
wykład 5 „Droga od genu do białka”
Przepływ informacji genetycznej
-trzy procesy przekazywania informacji
-kopiowanie i wyrażanie
-dlaczego jest RNA jako pośrednik?
-dzięki temu materiał genetyczny jest wydzielony
-różnice między Procariota a Eucariota
-aparat produkcji białek nie musi się tłoczyć przy DNA
-DNA nie podlega wpływom procesów metabolicznych zachodzących w komórce
-mniej uszkodzeń w DNA
-RNA daje etap wzmacniania – mniej reakcji chemicznych zachodzi na DNA
-dodatkowy poziom regulacji
Transkrypcja
-proces przepisywania DNA na RNA, który potem najczęściej jest matrycą do tworzenia białek
-RNA
-zamiast Tyminy Uracyl
-zamiast deoksyrybozy ryboza
-dużo mniejsza stabilność
-reakcja enzymatyczna
-enzymem jest polimeraza RNA
-kompleks białkowy budujący RNA na matrycy DNA
-regulacja
-znaczenie dla procesów biologicznych
-miejsce inicjacji, jej wydajność i miejsce terminacji wyznaczają sekwencje DNA (elementy cis) i wiążące się do nich specyficznie białka (elementy trans)
-inicjacja transkrypcji
-jak zapada decyzja gdzie ma się zacząć transkrypcja i z jaką wydajnością?
-kluczowe znaczenie sekwencji regulatorowych i wiążących się do nich białek
-u E. coli
-sekwencje –35 – wiąże się składnik polimerazy DNA i umożliwia inicjację replikacji
-sekwencja –10 – tam jest rozplatana podwójna helisa DNA
-start transkrypcji w miejscu +1
-oprócz tego bywają też inne sekwencje (motywy) regulatorowe
-u Eucaryota
-TATA box – tam wiąże się TBP, który ściąga polimerazę, tam też jest rozplatana podwójna helisa, zwykle -25
-potem obszar w którym są elementy regulacyjne do których wiążą się czynniki transkrypcyjne – białka ułatwiające lub utrudniające inicjację transkrypcji (do -500, -1000, granice płynne)
-potem duży obszar do –10000, gdzie mogą być enhancery – sekwencję do których wiążą się inne białka ułatwiające transkrypcję
-enhancery mogą być też za genem, mogą obsługiwać wiele genów, działają bo DNA się zagina
-elementy regulatorowe mogą być też w obszarze transkrybowanym
-białka oddziałujące z DNA ułatwiające lub utrudniające transkrypcję
-różny poziom specyficzności
-wrażliwe na właściwości fizyczne rozpoznają proporcję AT/GC lub skłonność do zginania się
-specyficzne sekwencyjnie rozpoznają krawędzie zasad
-na krawędziach różne grupy chemiczne o różnych właściwościach
-akceptory wiązania wodorowego
-donory wiązania wodorowego
-atomy wodoru
-grupy metylowe
-od dużej bruzdy 4 reszty
-od małej bruzdy 3 reszty (nie da się odróżnić AT od TA i CG od GC)
-fragment białka włazi do bruzdy i jeśli pasuje to silnie się łączy
-struktura białka często narzuca cechy sekwencji
-sekwencje palindromiczne
-obszary o sekwencji nierozpoznawanej
-motyw helisa – pentla – helisa
-motyw palca cynkowego
-motyw suwaka leucynowego
-zdolność do wiązania się z DNA może być regulowana
-modyfikacje kowalencyjne – fosforylacja
-przyłączenie liganda – hormon sterydowy
-zasadnicze znaczenie dla funkcji
-dwuczęściowa budowa wiekszości czynników transkrypcyjnych
-domena oddziałująca z DNA
-domena aktywująca – oddziałująca z polimerazą DNA
-przebieg inicjacji transkrypcji u E. coli
-niespecyficzne związanie z DNA
-skanowanie DNA w poszukiwaniu promotora
-specyficzne związanie z promotorem
-rozplecenie DNA i utworzenie bąbla transkrypcyjnego
-rozpoczęcie syntezy RNA
-bakteryjna polimeraza DNA
-jeden z największych enzymów w komórce
-co najmniej 5 podjednostek
-jedna katalityczna (beta)
-jedna rozpoznaje promotor (sigma)
-różne podjednostki sigma nadają specyficzność – alternatywne czynniki sigma
-oprócz niej różne białka związane do DNA ułatwiają lub utrudniają inicjację transkrypcji
-cały holoenzym szuka promotora
-przebieg inicjacji transkrypcji u Eucaryota
-najpierw związanie ogólnych czynników transkrypcyjnych do promotora
-potem związanie polimerazy
-przejście od inicjacji do elongacji – fosforylacja CTD (domeny C-końcowej; kilkadziesiąt powtórzeń Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser)
-trzy eukariotyczne polimerazy RNA
-pol I
-transkrypcja rybosomalnego RNA
-strukturalny składnik rybosomów
-geny rRNA występują w tandemowych powtórzeniach (po kilkadziesiąt kopii) na różnych chromosomach
-tworzą jąderko
-potrzebne w ogromnych ilościach – rybosomów jest bardzo dużo
-struktura choinki – badzo częsta inicjacja transkrypcji kolejnych RNA
-po to osobna polimeraza
-pol II
-transkrypcja genów kodujących białka (większość genów)
-złożony układ regulacyjny – te geny trzeba najbardziej regulować
-mRNA podlega dojrzewaniu
-pol III
-tRNA i 5S rRNA
-transport i rybosomy
-często promotor w sekwencji kodującej RNA
-synteza innych krótkich RNA
-też potrzebne w dużych ilościach
-elongacja
-synteza RNA
-substratami są trifosforany nukleozydów
-polaryzacja – dołączanie nukleotydów tylko do końca 3’ nici
-problem rozplatania podwójnej helisy
-DNA jeśli jest złapany za końce nie może się obkręcać
-jeżeli coś go na siłę rozkręca, to powstaje superskręcenie
-DNA się zwija
-podobnie jest z plazmidami
-poruszająca się polimeraza wprowadza superskręty (bo cząsteczka jest bardzo długa i przez to końce są unieruchomione)
-coś musi rozładowywać to napięcie
-topoizomeraza DNA
-są też enzymy wprowadzające superskręty
-poliemraza bakteryjna: kilkaset nukleotydów na minutę, ale geny max. kilka tysięcy bp.
-polimeraza eukariotyczna: do 2000 nukleotydów na minutę, ale geny czasem bardzo długie
-transkrypcja genu dystrofiny (2400kb) 20 godzin
-terminacja
-różne elementy sekwencyjne powodujące terminację
-albo motyw sekwencyjny rozpoznawany przez jakieś białko
-albo obszar przyjmujący strukturę o szczególnych cechach (spinka, rho)
-dla czego jest potrzebna?
Obróbka RNA
-u Procaryota praktycznie nie ma obróbki RNA – translacja zachodzi kotranskrypcyjnie
-dołączanie czapeczki do końca 5’
-RNA jest bardzo niestabilny
-RNazy są bardzo odporne
-normalnie szybka degradacja przez egzonukleazy
-pierwszy nukleotyd zostaje jako trifosforan
-dołączenie guanozyny przez wiązanie 5’-5’
-metylacja różnych reszt – różna u różnych grup organizmów
-zachodzi kotranskrypcyjnie
-wiążą się do niej różne białka i ma znaczenie przy dalszych krokach obróbki RNA
-poliadenylacja
-na końcu 3’ dojrzałych mRNA zwykle jest około 200 A
-nie zapisane w DNA, ale dodane po zakończeniu transkrypcji
-do poliA wiążą się białka stabilizujące RNA, również ma znaczenie w translacji
-transkrypt pod koniec jest rozcinany i polimeraza poliA dodaje A
-na końcu genu musi być sygnał poliadenylacji – on wyznacza miejsce
-znaczenie dla konstrukcji organizmów transgenicznych
-splicing
-geny zawierają introny
-sprawdzano, czy mRNA jest kolinearny z DNA
-u bakterii jest
-u Eucaryota w hybrydzie RNA-DNA powstają pętle widoczne pod mikroskopem elektronowym
-fragmenty obecne w DNA są wycinane z RNA
-wycinane fragmenty – introny
-fragmenty pozostające – egzony
-proces wycinania – splicing
-egzony często kodują strukturalnie wyodrębnione fragmenty białka lub domeny
-znaczenie intronów w ewolucji białek
-zachodzi w jądrze komórkowym
-introny są usuwane, egzony zostają w swojej kolejności i są łączone ze sobą
-granice między intronami a egzonami wyznaczają sekwencje
-słabo konserwowane
-trudne do przewidzenia
-miejsce splicingowe 5’ – koniec 3’ egzonu dołącza się do sekwencji rozgałęzienia w intronie –
-tworzy się cząsteczka w kształcie lassa
-koniec 5’ intronu pozostaje wolny
-miejsce splicingowe 3’ jest rozcinane i koniec 3’ egzonu dołącza się do końca 5’ drugiego egzonu
-co katalizuje splicing?
-cząsteczki snRNP
-RNA nadaje im specyficzność sekwencyjną
-przyłączają się do miejsc splicingowych 5’ i 3’ oraz do sekwencji rozgałęzienia
-redagowanie RNA (editing)
-centralny dogmat biologii molekularnej
-posttranskrypcyjna zmiana sekwencjiRNA
-rzadkie zjawisko
-u niektórych organizmów (Trypanosoma) ma duże znaczenie
-regulowane przez RNA
-dojrzewanie RNA niekodujących
-cięcie prekursora rRNA na kawałki
-obcinanie końcówek tRNA
Translacja
-najważniejsze cechy translacji
-synteza białka na matrycy RNA – sekwencja RNA wyznacza sekwencję białka
-zachodzi w rybosomach
-za interpretację kodu genetycznego odpowiada tRNA
-inicjacja translacji
-związanie czynników inicjujących (IF) do podjednostki 30S
-związanie 30S do mRNA w miejscu inicjacji
-u Eucaryota przyłącza się do czapeczki i przesuwa wzdłuż mRNA w poszukiwaniu kodonu AUG
-AUG musi być w odpowiednim kontekście sekwencyjnym
-przyłączenie tRNA
-przyłączenie podjednostki 50S
- u Eucaryota inne oznaczenia podjednostek rbosomu, inne białka inicjacyjne
-anatomia rybosomu
-rybosom tworzy się tylko na mRNA – nie ma niefunkcjonujących rybosomów
-mRNA
-mała podjednostka
-duża podjednostka
-miejsce A (aminoacylowe)
-tam wiąże się aminoacylo-tRNA
-nowo przyłączony tRNA z aminokwasem
-miejsce P (peptydylowe)
-tam wiąże się peptydylo-tRNA
-poprzedni tRNA dołączony do peptydu
-polipeptyd
Prace naukowe – ciąg dalszy
-skąd mamy wiedzieć, czy wierzymy w wyniki pracy, którą czytamy
-nikt nie żąda dowodów rzeczowych
-podstawą w nauce jest zaufanie
-zdarzają się błędy w dobrej wierze
-zdarzają się fałszerstwa
-oszustwo co do listy autorów
-wymyślenie wyników, żeby były ciekawe lub żeby były bardziej przekonujące
-pominięcie wyników niewygodnych (do pewnego stopnia dopuszczalne)
-sprawa zimnej fuzji
-fuzja termojądrowa – najpotężniejsze teoretyczne źródło energii
-potrzebne ogromne ciśnienia i temperatury
-zimna – podczas elektrolizy ciężkiej wody deuter zatęża się w elektrodzie i dochodzi do fuzji
-Fleischmann i Pons
-sensacyjna publikacja w Nature
-okazało się, że to była pomyłka – niedokładna aparatura, wahania napięcia w sieci i złe zaprojektowanie eksperymentu
-pierwszy artykuł zaprzeczający zimnej fuzji – adwokat F i P napisał groźny list do autora
-nie potwierdziło się
-dzisiaj zimna fuzja wegetuje razem z bioenergoterapią itp.
-co za idiota to recenzował?
-sprawa Schona
-genialny fizyk
-kilka prac w Nature i Science rocznie
-kandydat do Nobla
-ktoś zauważył, że w trzech różnych pracach jest ten sam wykres (identyczny szum)
-inne dane nierealistycznie precyzyjne – robił sobie wykresy z funkcji
-przeprowadzono dochodzenie – okazało się, że najciekawsze punkty swoich prac pozmyślał
-wielka awantura, podejrzenia padły na licznych współpracowników
-sposoby mierzenia jakości prac
-własna ocena czy praca jest ciekawa
-prestiż pisma w ramach danej dziedziny
-indeks cytowań
-ile razy dana praca została zacytowana
-jeśli cytują, znaczy że ważna
-czasem prace w gorszych pismach są dużo cytowane, a w lepszym wcale nie są cytowane
-premiuje modne i duże dziedziny
-Impact Factor
-wskaźnik czasopisma
-ile razy przeciętna praca z danego pisma została zacytowana w ciągu roku
-promuje pisma z modnych dziedziń, zwłaszcza medyczne
-promuje pisma z artykułami przeglądowymi
-problem z różnymi kategoriami artykułów
-punktacja KBN
-spłaszczenie
-jak dawać wszystkim po równo