Andrzej Wierzbicki
konspekt wykładu z genetyki ogólnej
wykład 7 „Regulacja ekspresji genów”
-sekwencjonowanie genomów
-jak ustala się sekwencję cząsteczki DNA
-metoda terminacji łańcucha (Sanger, 1975)
-synteza DNA na matrycy – polimeraza DNA
-starter – niezbędny polimerazie do zainicjowania syntezy, wyznacza miejsce startu
-bufor zawiera substancje niezbędne do działania polimerazy w tym dNTP
-jeden z dNTP jest zamieniony na dideoksyNTP
-polimeraza nie odróżnia deoksy od dideoksy i wstawia je, ale dalsza elongacja nie może zajść – brak 3’-OH do utworzenia następnego wiązania
-powstaje pula cząsteczek kończących się na dany nukleotyd
-cztery reakcje z czterema ddNTP
-używa się promieniotwórczego nukleotydu (w starterze) – można odczytać wzór prążków
-elektroforeza DNA
-sposób na rozdzielenie cząsteczek DNA o różnej długości
-pole elektryczne powoduje, że DNA się przesuwa
-żel stawia im opór proporcjonalny do wielkości cząstek
-małe poruszają się szybko, duże poruszają się wolno
-uwidocznienie DNA przez autoradiografię lub barwienie bromkiem etydyny
-prążki – skupiska cząsteczek o tej samej długości
-wzór prążków – sekwencja DNA
-zasięg reakcji – maksimum 1000 nukleotydów
-co zrobić aby w praktyce zsekwencjonować DNA?
-matryca
-odpowiedni fragment DNA
-najczęściej w wektorze
-startery
-wyznaczają początek reakcji sekwencjonowania
-najczęściej stosuje się startery do wektora
-można zaprojektować samemu
-reakcja i elektroforeza – to robią wyspecjalizowane laboratoria
-wyniki
-odczytana automatycznie sekwencja
-wynik elektroforezy z którego odczytano sekwencję
-sekwencjonowanie ze znacznikami fluorescencyjnymi
-ddNTP wyznakowane fluoroforami
-można je puścić w jednej ścieżce w żelu
-detektor sczytuje kolory i automatycznie odczytuje sekwencje
-jak zsekwencjonować genom?
-główny problem: reakcja sekwencjonowania sięga maksimum na 1000 nukleotydów
-rozwiązania
-startery co 500 nukeotydów – ale nie znamy sekwencji i ogromny koszt
-pocięcie genomu na krótkie fragmenty, wstawianie do wektora i sekwencjonowanie – to się robi
-jak pociąć DNA na kawałki i kontrolować kolejność kawałków?
-cięcie losowe enzymami lub przez sonikację
-post factum ustalanie jakiś cech uzyskanych klonów i ustalanie w jakiej są kolejności – ale bardzo pracochłonne
-metoda shotgun – sekwencjonowanie losowych fragmentów na dużą skalę i martwienie się później
-jak zsekwencjonować sekwencje repetytywne?
-jak uniknąć błędów polimerazy?
-jak ustalić ile jest powtórzeń?
-metoda shotgun
-zamiast mozolnego ustalania sekwencji klonów sekwencjonowanie wszystkiego co się da i potem składanie w komputerze
-znajdowanie sekwencji, które na siebie zachodzą końcami
-możliwe dzięki ogromnej wydajności komputerów
-luki na sekwencje repetytywne muszą być jakoś zapełnione – mapa fizyczna i większe klony
-po raz pierwszy zastosowana do Haemophilus influenze
-zsekwencjonowane genomy
-bardzo wiele (66) prokariotycznych, w tym szereg chorobotwórczych (Helicobacter pylori, Mycoplasma pneumoniae, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Vibrio cholerae, Salmonella,
-wszystkie główne organizmy modelowe (drożdże, C.elegans, Drosophila, Arabidopsis, mysz)
-szereg eukariotycznych chorobotwórczych
-niektóre rośliny użytkowe (ryż, kawa, pszenica)
-szereg szczególnie ciekawych (np. Ciona intestinalis)
-człowiek
-znaczenie zsekwencjonowania genomu człowieka
-mnóstwo danych
-trudności interpretacyjne
-przydatność do badań
-po co regulacja ekspresji genów?
-w rozwoju wzór ekspresji genów się zmienia
-różne komórki i różne tkanki
-zmiany wzoru ekspresji genów odpowiadają za regulację rozwoju
-w różnych warunkach różne geny są potrzebne
-dodanie galaktozy do pożywki na której rosną bakterie – aktywacja genów odpowiedzialnych za katabolizm galaktozy
-zmiana temperatury – aktywacja ekspresji genów kodujących białka ułatwiające adaptację do innej temperatury
-w wielu chorobach jest defekt regulacji ekspresji pewnych genów
-w nowotworach często obniżenie ekspresji supresorów nowotworów lub zwiększenie ekspresji genów sprzyjających powstawaniu nowotworów
-w zespole Downa zbyt wysoki poziom ekspresji niektórych genów chromosomu 21
-w cukrzycy typu II zbyt niska ekspresja genów kodujących receptor insuliny
-właściwy poziom ekspresji genów jest potrzebny w organizmach użytkowych
-zborze bogate w gluten
-rzepak z niewielką zawartością szkodliwych substancji
-mleko o wysokiej zawartości białka
-poziomy regulacji ekspresji genów
-od genu do białka jest długa droga
-każdy z szeregu procesów może być regulowany
-najważniejsze to transkrypcja, stabilność RNA, translacja i stabilność białka
-niektóre inne poziomy regulacji są stosowane raczej rzadko
-dostęp do DNA
-dlaczego dostepność do DNA może być ograniczona
-aparat transkrypcyjny musi fizycznie połączyć się z właściwym DNA
-DNA człowieka ma długość 10 m, a jądro komórkowe kilka mikrometrów
-DNA musi być jakoś pozwijane – trudno się dostać do supła do środka
-DNA jest związany z białkami – mogą uniemożliwiać wiązanie aparatu transkrypcyjnego
-różnice między Procariota a Eucariota
-na czym polega upakowanie DNA
-nawinięcie na oktamery histonowe
-DNA jest nawinięty na szpulki złożone z białek histonowych
-po dwie cząsteczki H2A, H2B, H3 i H4
-około 150 bp nawinięte na rdzeń, 50 bp łącznika
-około dwa owinięcia DNA na rdzeniu
-obraz z mikroskopu elektronowego – koraliki
-struktura nukleosomu
-w miejscu gdzie jest nukleosom nie ma dostępu do DNA
-trawienie nukleazą Micrococcus
-powstają fragmenty o długości 200, 400, 600 etc.
-nie jest w stanie strawić na nukleosomie
-struktury wyższego rzędu
-koraliki zwijają się w grubsze włókno 30 nm – solenoid czy zygzak
-włókno 30 nm zwija się w pętle
-pętle w czasie mitozy zwijają się w chromosom
-słabo poznane, brak dobrych technik ich badania
-regulacja struktury nukleosomowej chromatyny
-euchromatyna i heterochromatyna – obszary o rozluźnionej lub skondensowanej strukturze
-widoczne w jądrze komórkowych
-heterochromatyna zwykle skupiona przy otoczce jądrowej
-dość silnie determinują aktywność transkrypcyjną genów w danym obszarze
-obszary mogą być heterochromatynizowane – inaktywacja genów w danym obszarze
-przesuwanie nukleosomów
-odsuwanie z obszarów wiązania czynników transkrypcyjnych
-kompleksy remodelujące chromatynę
-efekt lokalny versus globalny
-inne odmiany remodelingu chromatyny
-modyfikacje histonów
-mogą rozluźniać strukturę
-mogą być sygnałem dla czynników przesuwających nukleosomy lub dla białek strukturalnych
-znaczenie struktury chromatyny w biotechnologii
-efekt pozycyjny
-specjalne sekwencje mogą wpływać na strukturę chromatyny wokół transgenu
-metylacja DNA
-bardzo istotne zjawisko kontrolujące dostępność do DNA
-przyłączenie grupy metylowej do cytozyny
-nie zmienia właściwości fizycznych DNA
-zmienia wzór grup chemicznych w dużej bruździe – niektóre czynniki transkrypcyjne nie mogą się wiązać do swojej sekwencji w DNA
-białka rozpoznające metylowane DNA
-wiążą się
-ściągają inne białka i powodują zamknięcie chromatyny w danym obszarze
-wyłączenie ekspresji genów
-wyspy CpG w promotorach genów ssaków
-możliwość podtrzymywania podczas podziałów komórkowych
-metyltransferazy de novo
-stan chromatyny może być podtrzymany pomimo zachodzących podziałów
-możliwość stałego wyciszenia sekwencji szkodliwych (transpozony, wirusy etc.)
-znaczenie w chorobach
-inicjacja transkrypcji
-decyzja, który gen będzie ulegał w danym momencie transkrypcji
-u bakterii decydującą rolę gra czynnik sigma
-alternatywne czynniki sigma decydują, które geny mają w danym momencie zostać aktywowane
-aktywność czynników sigma może być aktywowana w inny sposób
-operon laktozowy
-przykład jak geny są regulowane na poziomie inicjacji transkrypcji
-białko reguluje ekspresję innych genów
-gen beta-galaktozydazy – po podaniu laktozy jego ekspresja silnie wzrasta (więcej białka) – indukowany (nie konstytutywny)
-mutacja lacI- - beta galaktozydaza zawsze produkowana – konstytutywny (nie indukowany)
-mutacja mapuje blisko genu LacZ
-pytanie 1: czy lacI to sekwencja DNA (czynnik cis) regulująca ekspresję i mutant lacI- ma te sekwencje permanentnie aktywną, czy lacI koduje produjcję jakiegoś ruchomego czynnika (trans), np białka regulującego ekspresję genu?
-sprawdzenie dominacji
-jeśli czynnik cis – mutacja lacI- powinna być dominująca (jeden permanentnie aktywny zapewnia ciągłą produkcję)
-jeśli czynnik trans – mutacja lacI- powinna być recesywna (czynnik produkujący przez drugi allel wykonuje swoją funkcję)
-bakterie są zawsze haploidalne, skąd wziąć diploidalną bakterię?
-zjawisko koniugacji – przekazują sobie plazmidy, niekiedy przekazują fragmenty genomu
-można uzyskać częściowe diploidy (meridiploidy) – dwie kopie danego obszaru genomu
-jak odróżnić te bakterie, które dostały akurat LacI i LacZ?
-tuż obok tych genów na chromosomie jest gen biosyntezy proliny, mutant PRO- nie rośnie na pożywce bez proliny
-koniugacja PRO+ x PRO- tylko biorcy, którzy wzięli PRO i przy okazji LacI i LacZ rosną na pożywce bez proliny
-jak odróżnić biorców z PRO+ od dawców?
-dawcy mają gen wrażliwości na faga T6
-krzyżówka T6S PRO+ x T6R PRO-
-dodanie faga, dawcy zostają zabici
-krzyżówka T6S PRO+ lacI- lacZ+ x T6R PRO- lacI+ lacZ-
-fenotyp dziki (do ekspresji lacZ potrzeba galaktozy)
-więc lacI produkuje czynnik działający trans, również na drugi allel, przemieszczający się
-pytanie 2: czy produkt genu lacI działa negatywnie czy pozytywnie na ekspresję LacZ?
-negatywnie: przy braku galaktozy jest związany z genem lacZ i hamuje jego ekspresję, a gdy pojawi się laktoza represja ustaje, zmutowany jest zawsze nieaktywny
-pozytywnie: w obecności galaktozy wiąże się z genem lacZ i aktywuje jego ekspresję, zmutowany jest zawsze aktywny
-koniugacja przerywana
-lacI+ lacZ+ x lacI- lacZ-
-mieszał szczepy, koniugacja zachodzi z grubsza synchronicznie
-w odstępach czasu część zabierał i przerywał koniugację homogenizując
-nie rozkładają laktozy
-wchodził gen lacZ+ - konstytutywna aktywność
-potem wchodził lacI+ - indukowana aktywność
-dowód, że lacI koduje represor
-zasada działania operonu laktozowego
-LacI koduje represor działający w trans
-represor jest związany z sekwencją operatora i uniemożliwia transkrypcję
-gdy pojawia się laktoza, wiąże się z represorem i powoduje, że represor odczepia się od operatora
-jeszcze jeden system regulacji
-glukoza jest preferowanym substratem odżywczym
-w obecności glukozy LacZ nigdy nie jest produkowany
-przy braku glukozy białko CRP wiąże się z promotorem LacZ i ułatwia inicjację transkrypcji
-tak regulowanych jest wiele genów katabolizmu alternatywnych źródeł węgla
-powstające mRNA koduje nie tylko LacZ, ale jeszcze dwa inne geny katabolizmu laktozy
-to jest operon
-znaczenie w koregulacji ekspresji genów o wspólnej funkcji
-u bakterii operony występują często
-u Eucariota dużo rzadziej
-inicjacja transkrypcji u Eucaryota
-większe skomplikowanie – więcej regulacji
-podstawowe czynniki transkrypcyjne – niewielkie znaczenie regulacyjne
-czynniki transkrypcyjne wiążące się z elementami regulatorowymi i enhancerami – one regulują inicjację transkrypcji
-regulacja i.t. przez receptory hormonów sterydowych
-hormon sterydowy łączy się w białkiem receptorowym
-receptory zmieniają strukturę, tworzą dimery i przemieszczają się do jądra komórkowego
-receptory wiążą się ze specyficznymi sekwencjami w promotorach wybranych genów i je aktywują
-terminacja transkrypcji
-wybór miejsca terminacji transkrypcji
-może wyłączać geny w operonie lub zachodzić na początku transktyptu
-antyterminacja
-białko antyterminacyjne powoduje, że pierwszy terminator jest omijany
-zachodzi ekspresja drugiego genu w operonie
-regulacja kolejnych genów potrzebnych w infekcji faga lambda
-atenuacja
-regulacja genów biosyntezy aminokwasów
-gdy brak danego aminokwasu, translacja nie może zachodzić i rybosom się zatrzymuje
-polimeraza może wyczuwać takie zatrzymanie (translacja kotranskrypcyjna) – wtedy aktywnie działać
-gdy rybosom się przesuwa powoduje przedwczesne zakończenie transkrypcji
-alternatywny splicing
-składanie egzonów w różny sposób pozwala uzyskiwać różne białka z jednego genu
-omijanie egzonu – białko z egzonem lub bez
-zachowanie intronu – często powstaje krótsze białko, bo w intronie jest kodon stop
-wybór egzonu zaczynającego mRNA – alternatywne promotory
-wybór egzonu kończącego mRNA
-degradacja RNA
-mRNA jest przeważnie degradowane szybko
-okres półtrwania mRNA bakteryjnego – koło kilku minut
-eukariotyczne mRNA od minuty do pół godziny
-sekwencja mRNA jakoś wpływa na stabilność – mechanizmy słabo znane
-szlak zależny od deadenylacji
-w pewnych sytuacjach usunięcie poliA
-potem usunięcie czapeczki
-dekradacja przez egzonukleazy
-sekwencje wpływające na stabilność mRNA
-powtórzenia AUUUA w 3’UTR – szybka degradacja
-interferencja RNA
-degradacja RNA sterowana przez dwuniciowe RNA
-różnego rodzaju nieprawidłowe RNA często ma strukturę dwuniciową
-wirusy
-transpozony
-sekwencje repetytywne
-transgeny
-dwuniciowy RNA jest cięty na krótkie 21-25 nukleotydowe fragmenty
-one nadają specyficzność sekwencyjną RNazie w RISC
-zjawisko niedawno odkryte i intensywnie badane
-inicjacja translacji
-regulacja ogólnego poziomu syntezy białek
-białek nie można produkować więcej niż jest dostępnych zasobów
-czynniki inicjacyjne mogą być fosforylowane gdy trzeba obniżyć ogólny poziom syntezy białek
-przy szoku cieplnym
-wirusy wyłączają translację genów bakteryjnych
-regulacja przez dostępność aminoacylo-tRNA
-regulacja specyficzna
-białka rybosomalne E.coli
-cząsteczka mRNA ma w 5’UTR miejsce wiązania białka, które koduje
-zsyntetyzowane białko normalnie łączy się z rRNA i tworzy podjednostkę rybosomu
-gdy cały rRNA wmontowany jest w rybosomy, białko wiąże się z mRNA i blokuje inicjacji translacji
-ferrytyna u ssaków
-białko magazynujące żelazo
-w 5’UTR jest miejsce wiązania białek regulacyjnych
-przy braku żelaza tam siedzą i blokują inicjację translacji
-gdy zwiążą się z żelazem, odłączają się od mRNA i rusza translacja
-transferyna u ssaków
-transporter żelaza
-mechanizm podobny tylko działa w odwrotną stronę
-od białka regulacyjnego odłącza się żelazo i wtedy białko się odczepia
-uruchomienie translacji przy braku żelaza
-transport białka
-komórki Eucariota są podzielone na kompartmenty
-białka spełniają funkcję w odpowiednich kompartmentach
-większość białek ma adres w sekwencji – peptyd sygnałowy
-z nim oddziałują białka transbłonowe i przeciągają na drugą stronę
-peptyd sygnałowy jest potem odcinany
-transport do wnętrza mitochondriów – dwa peptydy sygnałowe
-przekazanie białka do ER – transport kotranslacyjny, szorstkie ER, transport na zewnątrz
-znaczenie sekrecji białek w biotechnologii
-cięcie białka
-rozcinanie na kilka kawałków (poliproteiny), każdy jest funkcjonalnym białkiem
-hormony białkowe u zwierząt
-wiele białek bakteryjnych i wirusowych
-odcinanie końcówek
-białka bardzo agresywne – często synteza w postaci nieaktywnego prekursora
-białko jadu pszczoły – prekursor z 22 dodatkowymi aminokwasami na N-końcu
-specjalna proteaza tuż przed wydzieleniem na zewnątrz odcina peptyd i aktywuje białko jadu
-wycinanie fragmentu ze środka
-obróbka preinsuliny
-odcinanie końcówki i wycinanie fragmentu ze środka
-inteiny – introny białkowe
-ograniczone znaczenie regulacyjne cięcia białek
-modyfikacje posttranslacyjne białka
-dołączanie do aminokwasów różnych grup chemicznych
-zmiana właściwości fizycznych białka
-znaczenie dla jego lokalizacji
-znaczenie dla jego funkcji
-znaczenie regulacyjne
-czasem dokonywane zaraz po translacji na stałe
-czasem aktywnie zmieniane służą do regulacji aktywności białka
-szczególne znaczenie w histonach