Andrzej Wierzbicki

konspekt wykładu z genetyki ogólnej

wykład 8 „Replikacja, mutacje”

-degradacja białka

-białka niepotrzebne powinny być szybko usuwane – niezbędne dla regulacji

-na poziomie ekspresji możliwa tylko regulacja pozytywna, do regulacji negatywnej potrzeba degradacji białek

-długość życia białek jest bardzo różna

-od pojedynczych minut do bardzo długiego czasu

-znaczenie N-końcowego aminokwasu

-stabilizujące i destabilizujące

-ubikwityna

-wiele białek ma sekwencje segradacji (np PEST)

-sekwencja jeśli jest eksponowana, ściąga ubikwitynę

-ubikwityna – krótkie białko przyczepiane do innych białek, które mają zostać zdegradowane

-białka z ubikwityną są wciągane do proteasomu

-beczułka

-w środku są aktywności proteazowe

-białko cięte na kawałki po kilkanaście aminokwasów – po docięciu mogą być znowu użyte

-wyobrażenie procesów ekspresji genów

-niezależne procesy

-między jednym a drugim jest przerwa

-ściśle powiązane zjawiska

-następne się zaczyna gdy poprzednie się jeszcze nie skończyło

-interferencja RNA

-zjawisko niedawno odkryte, które okazało się mieć ogromne znaczenie

-przykład, że w biologii zostało jeszcze coś do dokrycia

-mechanizm RNAi

-zaczyna się od „abberant RNA” – dsRNA

-wirusy, transpozony, sekwencje repetytywne, transgeny

-sekwencje specjalnie kodujące dwuniciowe RNA – prekursory miRNA

-sekwencje wprowadzone, aby coś wyciszyć

-RNA, który był jednoniciowy, ale druga nić rostałą dobudowana przez RDRP

-dsRNA wykrywany przez RNazę Dicer

-on od końca, procesywnie odcina po 21-25 nukleotydów

-cząsteczki dwuniciowe

-charakterystyczna budowa końcówek

-krótkie RNA steruje szeregiem procesów

-cięcie innych RNA o komplementarnej sekwencji

-wbudowanie w kompleks RISC o aktywności RNAzy

-specyficzność sekwencyjną nadaje krótkie RNA

-primowanie syntezy drugiej nici RNA przez RDRP

-hamowanie translacji

-metylacja DNA i modyfikacje chromatyny

-wbudowanie w kompleks RITS

-nakierowuje metylację DNA i modyfikacje histonów w obszar o komplementarnej sekwencji

-jaki jest mechanizm działania siRNA na DNA i chromatynę?

Replikacja DNA

-znaczenie

-powielenie materiału genetycznego

-niezbędne do rozmnażania komórek i organizmów

-wymaga wielkiej dokładności – uniknięcie błędów i zbytniego powielenia lub luk w powielaniu

-mechanizm semikonserwatywny replikacji

-inicjacja replikacji

-gdzie replikacja się zaczyna?

-miejsca nieprzypadkowe – miejsca ORI – wyznaczane mniej więcej przez sekwencję DNA

-jak znaleźć miejsce ori?

-przenoszenie fragmentów chromosomu do plazmidu

-plazmid – kulista cząsteczka DNA funkcjonująca podobnie do chromosomu bakteryjnego

-można go pozbawić własnego miejsca ori i wstawiać różne sekwencje, które chcemy sprawdzić

-można zawężać sekwencję, aby ustalić, który jej fragment jest naprawdę istotny

-tak badano ori bakteryjne i drożdżowe

-pulsowe znakowanie, wirowanie i PCR

-dokładne mapowanie miejsc ori u ssaków – niemożnośc stosowania plazmidów

-synchronizowane komórki znakowane pulsowo 5-bromouracylem

-nowo zsyntetyzowany DNA można wyodrębnić przez wirowanie w gradiencie chlorku cezu

-można sprawdzić do których fragmentów w danym rejonie genomu jest komplementarny (przez hybrydyzację)

-przenoszenie fragmentu genomu z ori do małpy

-wprowadzanie mutacji

-rola struktury chromatyny

-budowa miejsca ori u bakterii i inicjacja replikacji

-245 bp długości

-5 rozproszonych powtórzeń motywu 9bp

-3 powtórzenia motywu 13bp

-do motywów 9bp wiąże się białko DnaA – około 30 cząsteczek

-tworzą baryłkę dookoła której nawija się DNA

-powstaje napięcie torsyjne, które rozłącza nici DNA

-w motywach 13bp następuje rozłączenie nici (bogate w AT)

-do oczka przyłączają się białka DnaB i DnaC

-DnaB jest helikazą i rozplata dalej podwójną helisę

-przyłącza się polimeraza DNA i zaczyna replikować

-u drożdży budowa jest inna, ale schemat działania podobny

-przyłączają się białka, które powodują powstanie oczka na odpowiedniej sekwencji

-B3 – odpowiednik 9bp

-B2 – odpowiednik 13bp

-B1 i A – na stałe związane białka – regulacja replikacji w cyklu komórkowym

-oczko jest poszerzane przez helikazy i potem przyłącza się polimeraza DNA

-u ssaków

-ogromne trudności metodyczne

-podobieństwo aparatu białkowego do opisanego u drożdży

-trudności z precyzyjnym wyznaczeniem motywów sekwencyjnych

-udział modyfikacji chromatyny

-ile jest miejsc ori?

-u bakteri jedno

-u Eucariota wiele

-u drożdży 300 (40 kb na miejsce)

-u człowieka 20000 (150 kb na miejsce)

-replikacja idzie w dwóch kierunkach

-elongacja replikacji

-trzy ograniczenia procesu replikacji

-niemożność zaczynania syntezy DNA na jednoniciowej matrycy

-synteza tylko w orientacji 5’-3’

-ograniczenie topologiczne

-zaczynanie syntezy od starterów

-krótkie cząsteczki RNA wstawiane przez primazę (ona nie wymaga startera)

-polimeraza DNA może wydłużać starter

-inny sposób replikacji nici wiodącej i nici opóźnionej

-nić wiodąca – polimeryzacja ciągła

-nić opóźniona – polimeryzacja fragmentami

-robienie nowego startera

-fragmenty Okazaki 1000-2000 bp u bakterii, 200 bp u Eucaryota

-rozplatanie podwójnej helisy DNA

-niezbędne przed przejściem replikacji

-niezbędne na nowo zsyntetyzowanych niciach

-niezbędne aby rozdzielić dwie cząsteczki DNA jeżeli są zahaczone

-topoizomerazy DNA typu I i II

-usuwają zarówno dodatnie jak i ujemne superskręty

-zjawiska zachodzące podczas elongacji replikacji DNA

-topoizomeraza

-helikaza

-polimeraza III

-prymaza

-polimeraza III

-polimeraza I

-ligaza

-aktywności obecne w polimerazach DNA

-polimeraza 5’-3’ – synteza DNA, główna aktywność

-egzonukleaza 3’-5’ – usuwanie błędnie wstawionych nukleotydów, aktywność naprawcza, znaczenie dla wierności replikacji

-egzonukleaza 5’-3’ – usuwanie starterów; potem na ich miejsce wstawianie DNA, polimeraza DNA I

-terminacja replikacji

-u bakterii terminacja następuje zawsze w ustalonym miejscu

-przyczyna nieznana

-sekwencje terminatorowe

-wiąże się do nich białko terminujące Tus

-białko przepuszcza polimerazę DNA tylko w jednym kierunku -zatrzymuje helikazę DNA nadchodzącą z niewłaściwej strony

-dwie pary widełęk replikacyjnych spotykają się w obszarze między sekwencjami terminatorowymi

-jesli jedne widełki się opóźnią, drugie na nie czekają

-u Eucaryota prawdopodobnie widełki replikacyjne mogą spotykać się gdziekolwiek

-telomery

-replikacja nieciągła nici opóźnionej powoduje, że końcówka chromosomu zostaje niedoreplikowana

-skracanie chromosomu ogranicza liczbę możliwych podziałów komórkowych

-tak się dzieje u wielu organizmów

-komórki nie mogą się podzielić więcej niż kilkanaście, paredziesiąt razy

-rodzaj zabezpieczenia przez nowotworem – komórki nowotworowe powinny zamierać

-również niebezpieczeństwo – mogą ulec uszkodzeniu ważne geny, np supresory nowotworów

-w komórkach linii płciowej system zabezpieczajązy – telomery

-na końcu chromosomu sekwencja repetytywna TTAGGG (u człowieka)

-jak zostanie skrócona to nic się nie stanie

-system wydłużania niezależny od replikacji DNA

-telomeraza – enzym syntetyzujący DNA telomerowy

-synteza na matrycy wbudowanego w enzym RNA

-umożliwia niemalże dowolne wydłużenie telomerów

-aktywna tylko w odpowiednich komórkach

-nadmierna aktywność hamowana przez białka wiążące się do telomerów

-aktywowana w komórkach nowotworowych

-regulacja replikacji

-znaczenie – unikanie podziału z niedoreplikowaniem lub przereplikowaniem DNA

-cykl komórkowy - fazy

-punkty kontrolne cyklu komórkowego

-przed wejściem do fazy S – zapobiega nadmiernej proliferacji

-drugi przed wejściem do fazy M – zapobiega nadmiernej lub niepełnej replikacji

-punkty kontrolne pozwalają za zaczęcie podziału tylko w odpowiednim momencie

-regulacja w obrębie fazy S

-wczesne i późne miejsca replikacji

-funkcja nieznana

Mutacje

-mutacje – dziedziczne zmiany w sekwencji DNA

-rodzaje mutacji względem zmian w sekwencji DNA

-punktowe – zamiana jednego nukleotydu na inny

-delecje – usunięcie nukleotydów (od jednego do bardzo wielu, kwestia ramki odczytu)

-insercje – wstawienie nukleotydów (od jednego do bardzo wielu, kwestia ramki odczytu)

-rodzaje mutacji względem skutków dla działania genu

-synonimiczne – zmiana na inny kodon kodujący ten sam aminokwas (tylko punktowe)

-zmiany sensu – zmiana na kodon kodujący inny aminokwas (punktowe)

-nonsens – wstawienie kodonu stop (wszystkie)

-ominięcie kodonu stop (wszystkie; wydłużenie białka; przeważnie zachowuje aktywność)

-zmiana miejsca splicingowego (nieusuwanie intronu lub usuwanie intronu o innej wielkości)

-wstawienie lub usunięcie aminokwasów (insercja lub delecja)

-zmiana sekwencji regulacyjnej (wszystkie, zmiana wzoru ekspresji)

-przyczyny mutacji

-błędy replikacji

-wstawienie nukleotydu niekomplementarnego do matrycy

-aktywność naprawcza – egzonukleaza współzawodnicząca z polimerazą

-u E. coli 10 do -7 błędów

-na nici opóźnionej 20x więcej błędów – polimeraza I myli się częściej niż polimeraza III

-problem tautomerów

-izomery – forma ketonowa i enolowa lub aminowa i iminowa

-zdecydowanie dominuje forma ketonowa

-bardzo rzadko spontanicznie pojawia się forma enolowa

-ona jest komplementarna z innym nukleotydem

-enol-T – G

-imino-A – C

-enol-G – T

-tylko imino-C – też z G

-poślizg polimerazy

-nić matrycowa i nić nowa przesuwają się względem siebie

-powoduje delecję lub duplikację krótkiej sekwencji

-najczęściej na sekwencjach repetytywnych

-przyczyna zmienności sekwencji mikrosatelitarnych

-ekspansje trinukleotydowe

-w niektórych genach jest paredziesiąt powtórzeń jakiejś trójki – powtórzenia aminokwasu

-zdarza się, że robi się ich dużo więcej

-utrata funkcji białka i choroba

-pląsawica Huntingtona

-mogą też destabilizować chromosom

-mutageny chemiczne i fizyczne

-czynniki wywołujące mutacje – dziedziczne zmiany w sekwencji DNA

-działanie bezpośrednie i pośrednie

-analogi zasad

-bardzo podobne do zasad – polimeraza wstawia je na miejsce zasad

-trochę się różnią i powodują mutacje

-5-bromouracyl – analog tyminy

-komplementarna z nim jest A, ale dużo częściej wystepuje forma enolowa – komplementarna z G

-podczas nastepnej replikacji pojawia się mutacja punktowa

-2-aminopuryna – analog adeniny, forma iminowa częstsza komplementarna do cytozyny

-czynniki deaminujące

-powodują usunięcie grupy aminowej z zasad

-G -> ksantyna – blokuje replikację, niemutagenna

-A -> hipoksantyna – komplementarna do C

-C -> uracyl – komplementarny z A

-T – nie zawiera grupy aminowej

-takie właściwości ma kwas azotawy

-kwas siarkawy deaminuje tylko cytozynę

-czynniki alkilujące

-dodanie grupy alkilowej do zasady

-metylowa, acetylowa lub inne

-może zmieniać komplementarność zasady

-może łączyć dwie zasady, również z różnych nici

-może dodawać duże grupy blokujące transkrypcję

-metanosulfonian etylowy (EMS)

-halogenki metylu

-czynniki interkalujące

-płaskie cząsteczki wciskające się między pary zasad

-rozciągają DNA i powodują powstawanie małych insercji

-bromek etydyny

-UV

-powoduje dimeryzacje sąsiadujących zasad pirymidynwych, najczęściej dwie tyminy

-w czasie replikacji – delecja

-połączenie 6-4 – kowalencyjne połączenie atomów 6 i 4 sąsiadujących pirymidyn

-promieniowanie jonizujące

-powoduje mutacje punktowe, delecje, insercje i poważne uszkodzenia uniemożliwiające replikację

-znaczenie rodzaju promieniowania, jego siły i miejsca, gdzie jest źródło

-ciepło

-co pewien czas zachodzi spontaniczne odcinanie zasad

-temperatura zwiększa częstość

-są wydajnie napawiane

-mutacje chromosomowe

-mutacje strukturalne

-zmiany struktury chromosomów – przeniesienie całych fragmentów

-zbalansowane – wszystkich genów są po dwie kopie

-nie zbalansowane – niektórych genów jest mniej lub więcej niż dwie kopie

-to decyduje o skutkach dla fenotypu

-zachowanie funkcji centromeru decyduje o propagowaniu defektu

-przyczyną jest przerwanie chromosomu złączone później w nieprawidłowy sposób lub defekty crossing-over

-możliwe mutacje

-inwersja

-odwrócenie części chromosomu

-wymaga dwóch przecięć

- zbalansowana

-delecja

-usunięcie części chromosomu

-wymaga dwóch przecięć

-nie zbalansowana

-jeśli zostanie wycięty centromer – utrata całego chromosomu

-translokacja

-dwa różne chromosomy zamieniają cię fragmentami

-wymaga przecięcia każdego chromosomu

-zwykle zbalansowana

-może prowadzić do powstania jednego chromosomu bez centromeru i jednego z dwoma centromerami

-insercja

-przeniesienie fragmentu jednego chromosomu na drugi

-wymaga dwóch przecięć obu chromosomów

-zwykle zbalansowana

-może prowadzić do powstania jednego chromosomu bez centromeru i jednego z dwoma centromerami

-skutki

-poważne zmiany prowadzą do śmierci na bardzo wczesnym etapie

-mniejsze zmiany wywołują zaburzenia rozwojowe od słabych do bardzo poważnych

-niektóre zbalansowane nie powodują chorób, ale wywołują bezpłodność lub ograniczają płodność

-mutacje liczbowe

-zaburzenia liczby chromosomów

-poliploidalność

-do 3% ciąż ma 3n – dwa plemniki lub diploidalna gameta

-bardzo rzadko 4n – defekt pierwszego podziału zygoty

-u człowieka letalne

-aneuploidalność

-mniej lub więcej kopii jednego chromosomu

-trisomia – trzy chromosomy zamiast dwóch

-zespół Downa – trisomia 21 chromosomu

-monosomia – jeden chromosom zamiast dwóch

-zespół Turnera – monosomia X

-dla większości chromosomów letalne

-skutki mutacji chromosomowych u człowieka

-1/2 poronień w pierwszym trymestrze ciąży wynika z mutacji chromosomowych – większość (96%) to mutacje liczbowe

-trisomie 21 i X (zespół Downa)

-znaczenie chorób wywołanych mutacjami chromosomowymi

-poliploidalność u roślin

-u roślin poliploidalność nie jest letalna, a wręcz przeciwnie

-4n, 6n, 8n etc.

-rośliny są większe, a użytkowe niekiedy dają lepsze plony

-allopoliploidia – krzyżówki między gatunkami

-rzepak, pszenica, tytoń, ziemniak, kawa, bananowiec, trzcina cukrowa, truskawka

-wykorzystanie w praktyce – można sztucznie wywoływać (szpinak, jabłoń, winogrona, kwiaty ozdobne)

-przyczyny dość zagadkowe