DNA jądrowy w komórkach eukariotycznych występuje w postaci kompleksu nukleoproteinowego, zwanego chromatyną. Podstawową jednostką strukturalną chromatyny jest nukleosom. Jest to kompleks złożony z zasadowych białek zwanych histonami i z odcinka DNA o długości ok. 200 pz (par zasad). Zbudowaną z nukleosomów nić chromatyny porównywano do sznura pereł lub do koralików na sznurku, tak też istotnie wygląda na zdjęciach z mikroskopu elektronowego (van Holde, 1989). Wśród Eukariota histony i nukleosomowy typ budowy chromatyny występują uniwersalnie. Jedynie plemniki u większości kręgowców i komórki niektórych Dinoflagellatae nie zawierają histonów (Avranowa i inni, 1980; Uschewa i inni, 1982; Herzog i Soyer, 1981).
Struktura określana mianem nukleosomu składa się z tzw. cząstki rdzeniowej (ang. core particle), cząsteczki histonu H1 oraz fragmentu DNA o długości ok. 200 pz. Cząstka rdzeniowa jest centralnym i prawdopodobnie najstarszym ewolucyjnie elementem nukleosomu. Jej budowa jest na tyle regularna, że możliwe jest uzyskiwanie kryształów złożonych z cząstek rdzeniowych. Dzięki temu struktura tych cząstek mogła być rozwiązana
metodami rentgenograficznymi (Widom i Klug, 1985; Richmond i inni, 1984). Cząstkę rdzeniową tworzy kompleks ośmiu histonów (oktamer) zwanych histonami rdzeniowymi (H2A, H2B, H3 i H4), wokół oktameru owinięty jest odcinek DNA o długości 146 pz (Ryc.1C). Budowę i sposób powstawania oktameru dyktują właściwości cząsteczek histonów rdzeniowych. Wszystkie zbadane do tej pory histony rdzeniowe, od Archebakterii po ssaki, zawierają charakterystyczny motyw strukturalny, zwany zwinięciem histonowym (ang. histone fold) (Ryc. 1A). Domena ta pośredniczy w tworzeniu heterodimerów między cząsteczkami różnych histonów rdzeniowych umożliwiając im ścisłe oddziaływanie geometryczne przypominające uścisk dłoni (ang. hand shake) (Ryc. 1B). Kompletny oktamer histonowy ma budowę trójdzielną. Centralną jego część tworzy tetramer ułożony w kształcie litery V, zbudowany z dwóch heterodimerów (H3.H4). Do bocznych powierzchni tetrameru dołączone są heterodimery (H2A.H2B), które mają postać spłaszczonych sfer (Klug i inni, 1980; Arents i inni 1991). Analiza rentgenograficzna wykazuje, że na powierzchni kompletnego oktameru, histonowego występują charakterystyczne bruzdy i krawędzie o regularnym nachyleniu, które (dzięki dopasowaniu do geometrii podwójnej helisy) umożliwiają owinięcie się wokół oktameru niemal dwóch pełnych zwojów DNA (Arents i Modrianakis, 1995).
Jak pokazano na Ryc. 1C nie zestrukturalizowane N- i C- końcowe ogony histonów rdzeniowych nie wchodzą w skład ścisłego oktameru i wystają na zewnątrz cząstki rdzeniowej. Znacznie N- i C-końcowych fragmentów histonów rdzeniowych omawiane jest w dalszej części Wstępu.
W początkowej fazie trawienia chromatyny endonukleazą z Micrococcus (nukleaza mikrokokowa, MNaza) przecinany jest DNA międzynukleosomowy, zwany DNA łacznikowym lub linkerowym. W tej fazie długość minimalnego produktu trawienia odpowiada średniej długości nukleosomowego DNA (tzw. nucleosome repeat ) w komórce. Długość nukleosomowego DNA u eukariontów waha się od 160 do 220 pz, w zależności od typu komórki i organizmu (van Holde, 1989). W kolejnych fazach działania MNazy wytrawiany jest DNA linkerowy nie oddziałujący ściśle z histonami.. Pierwsze zatrzymanie trawienia następuje przy długości DNA ok. 160 pz, co odpowiada tzw. chromatosomowi, tj. cząstce rdzeniowej nukleosomu wraz z zasocjowanym z nią histonem H1. Histon ten chroni dodatkowo po ok. 10 pz po obu stronach cząstki rdzeniowej (Simpson, 1978). W miarę dalszego trawienia MNazą usuwany jest histon H1, a DNA zostaje skrócony do 146 pz, tj. do odcinka oddziałującego ściśle z oktamerem histonowym w cząstce rdzeniowej.
Histon H1 jest białkiem trójdomenowym, którego cząsteczka ma środkową domenę globularną i dwie silnie zasadowe, nie zestrukturalizowane domeny: N- i C-końcową. Obecnie istnieją dwa modele opisujące ułożenie H1 w nukleosomie. Pierwszy z nich (do tej pory powszechnie przyjmowany) zakłada, że domena globularna H1 wiąże się od strony zewnętrznej z obiema nićmi chromatosomowego DNA w miejscu gdzie DNA wchodzi i schodzi z nukleosomu, stabilizując pozycje tych odcinków na powierzchni oktameru. Dodatkowo DNA wiąże się ze skierowaną na zewnątrz mniejsza bruzdą centralnego zwoju DNA, dokładnie w rejonie osi symetrii nukleosomu. Drugi model, przedstawiony w ubiegłym roku przez A. Wolffego i E. Moundrianakisa zakłada, że H1 wiąże się z chromatosomowym DNA (z dużą bruzdą) tylko w jednym miejscu, asymetrycznie w stosunku do osi symetrii nukleosomu, i jest umiejscowiony nie na zewnątrz, a od strony wewnętrznej DNA owijającego się wokół oktameru. C-końcowy fragment H1 miałby być ułożony wzdłuż podwójnej helisy linkerowego DNA i skierowany w stronę następnego nukleosomu. Możliwe jest, że tego rodzaju umiejscowienie domeny globularnej H1 umożliwia jej oddziaływanie z histonem H2A (Pennisi, 1996; Pruss i inni, 1996). Spójność całego nukleosomu wynika ze specyficznego wiązania się histonów w heterodimery, oddziaływań typu białko-białko między heterodimerami, oddziaływań DNA z oktamerem oraz wiązania histonu H1 z DNA chromatosomu i (prawdopodobnie) białkami oktameru (Wolffe, 1994). Nie bez znaczenia pozostają także oddziaływania (słabo dotychczas poznane) nie zestrukturalizowanych ogonów histonów rdzeniowych i H1 z DNA linkerowym.
Model budowy cząsteczki jest wspólny dla wszystkich histonów rdzeniowych. Część odpowiedzialną za wiązanie się histonów między sobą, a także za tworzenie miejsc dla wiązania DNA stanowi silnie zestrukturalizowana domena globularna. Towarzyszą jej słabo zestrukturalizowane fragmenty, przede wszystkim N- końcowe, o nie wyjaśnionej do końca funkcji, tzw. ogony. Histon H1, jak wspomniano w poprzednim punkcie, ma budowę trójdomenową, z wyraźnie zaznaczonymi nie zestrukturalizowanymi fragmentami: N- i C-końcowym. Wszystkie histony są białkami zasadowymi, zawierają stosunkowo dużą liczbę lizyn i arginin. Zawartość tych aminokwasów jest zróżnicowana w zależności od histonu.. Na przykład H1 jest bogaty w lizynę, natomiast H3 i H4, jako główny aminokwas zasadowy zawierają argininę. Wszystkie histony zawierają nadwyżkę aminokwasów zasadowych nad kwaśnymi na skutek czego ich ładunek w fizjologicznym pH jest zawsze dodatni. Rozmieszczenie ładunku wzdłuż cząsteczki białkowej jest nierównomierne. Najsilniej dodatnie są N-końcowe ogony histonów (w przypadku histonu H1 także ogon C-końcowy). W części globularnej ładunki rozmieszczone są bardziej równomiernie. Jest to związane z różną funkcją tych domen (van Holde, 1989). Sekwencja aminokwasowa białek histonowych jest konserwowana ewolucyjnie. Jako pierwszy wykazał to DeLange w 1969 roku porównując sekwencje histonu H4 z cielęcia i z groszku. Okazało się, że H4 u obu tych organizmów zawiera 102 aminokwasy, z których tylko 2 są różne. Podobnie wysoko konserwowanym białkiem jest histon H3. Jednak już H2A i H2B wykazują sporą zmienność ewolucyjną, szczególnie w bogatych w lizyny i argininy ogonach. Natomiast ich część globularna jest znacznie bardziej konserwowana. Najbardziej zmiennym z histonów jest linkerowy H1, lecz i w tym białku struktura przestrzenna domeny globularnej wykazuje znaczną konserwatywność. Różnice w stopniu konserwatywności ewolucyjnej histonów wskazują na ich różne funkcje w tworzeniu nukleosomu.
Potranslacyjne modyfikacje histonów
Zróżnicowanie w obrębie ogonów histonów może mieć wpływ na sposób wiązania się DNA do oktameru, a co za tym idzie na regulatorową funkcję nukleosomów (Arents i Moudrianakis, 1995). Potwierdza to fakt, że wszystkie potranslacyjne modyfikacje białek histonowych dotyczą właśnie ogonów. Modyfikacje histonów obejmują acetylację, fosforylację, ubikwitynylację (dołączenie białka ubikwityny), metylację i ADP-rybozylację (van Holde, 1989) (Ryc. 2).
Szczególnie ciekawe są procesy odwracalne czyli, acetylacja i ubukwitynylacja lizyn oraz fosforylacja seryn i treonin. Obecnie w centrum szczególnego zainteresowania jest proces acetylacji histonów oraz białka odpowiedzialne za ten proces. Rezultatem acetylacji N-końcowych ogonów histonów H3 i H4 jest obniżenie dodatniego ładunku tych białek, a tym samym osłabienie ich wiązania z DNA (Cary, 1982). W ten sposób proces acetylacji może wspomagać transkrypcję na matrycy chromatynowej. Histon H4 jest modyfikowany przez acetylotransferazy w lizynach w pozycji 5, 8, 12 i 16 sekwencji aminokwasowej. Przypuszcza się, iż nie tylko acetylacja, ale i miejsce modyfikacji ma znaczenie w regulacji ekspresji genów. Za pomocą technik immunologicznych wykazano różne rozmieszczenie modyfikowanych izoform H4 w chromosomach politenicznych u Drosophila. Nie acetylowany histon H4 związany był z regionem heterochromatyny (chromatyna nieaktywna transkrypcyjnie), natomiast izoforma H4 z acetylowaną lizyną 16 związana była głównie z wysoko aktywnym transkrypcyjnie chromosomem X w komórkach męskich Drosophila. Uważa się, że H4 z acetylowaną lizyną 16 jest niejako markerem superaktywnego chromosomu X w komórkach męskich Drosophila (Lavender, 1994). Kolejne przykłady potwierdzające znaczenie acetylacji dotyczą komórek ssaczych. W komórkach żeńskich ssaków geny jednego z dwóch chromosomów X przestają być transkrybowane we wczesnych etapach rozwoju. Inaktywacja chromosomu X jest zwykle nieodwracalna. Stwierdzono, że poziom acetylacji histonu H4 związanego z nieaktywnym chromosomem X jest bardzo niski (Jeppensen i Turner, 1993). Wzbogacony w acetylowany H4 jest za to DNA zawierający sekwencje kodujące (R-bands) (Jeppesen i Turner, 1993). To samo dotyczy tzw. wysepek GpC zwykle występujących w pobliżu genów konstytutywnie eksprymowanych (housekeeping genes) (Tazi i Bird, 1990). Wzrost poziomu acetylacji obserwuje się również podczas dojrzewania spermatyd u zwierząt, tuż przed wymianą histonów na protaminy (Oliva i Mezquita, 1982; Grimes i Henderson, 1983, 1984). Acetylacja dotyczy wszystkich histonów rdzeniowych. Można przypuszczać, że modyfikacja ta powoduje rozluźnienie struktury chromatyny, co ułatwia wymianę białek. W ciągu ostatnich miesięcy udało się zidentyfikować kilka acetylotransferaz jądrowych. Ku ogromnemu zaskoczeniu okazało się, że niektóre z nich to od dawna znane aktywatory transkrypcji. Pierwszą acetylotransferazę, białko HAT A, zidentyfikowano w Tetrahymena. Białko HAT A jest podobne do drożdżowego czynnika transkrypcyjnego Gcn5p (Brownell i inni, 1996). Z kolei, po szczegółowym zbadaniu aktywności samego Gcn5 stwierdzono, że ten aktywator transkrypcji acetyluje histony H3 i H4 (Kleff i inni, 1995). Poznano także białka kierujące procesem acetylacji u człowieka. W trakcie badań nad onkogennym białkiem E1A adenowirusa, okazało się, że do aktywnego działania białko to musi być związane z komórkowym czynnikiem białkowym p300/CBP i dopiero w takim kompleksie białko E1A zmienia profil transkrypcyjny w zainfekowanej komórce i wpływa na jej cykl komórkowy. Wiadomo było, że białko p300/CBP wiąże się z niektórymi czynnikami transkrypcyjnymi i powoduje aktywację wielu genów. Nie poznano dotąd mechanizmu oddziaływania białka p300/CBP z innymi białkami, ale od niedawna wiadomo, że czynnik ten ma aktywność acetylotransferazy i może modyfikować wszystkie histony budujące rdzeń nukleosomu (Bannister i Kouzarides, 1996). Jako kolejną acetylotransferazę występującą w komórkach ludzkich poznano czynnik związany z białkiem p300/CBP (PCAF, cellular p300/CBP associated factor), który ma różną specyficzność niż białko p300/CBP i dołącza grupy acetylowe wyłącznie do histonów H3 i H4 (Yang i inni, 1996). Wyjątkowo ekscytującego odkrycia dokonali Nakatani i Allia, którzy zidentyfikowali ludzki czynnik TAFII 230/250 wchodzący w skład podstawowego czynnika transkrypcyjnego TFIID, jako kolejną acetylotransferazę (Mizzen, 1996). Z przytoczonych przykładów wynika, że acetylacja histonów ma olbrzymie znaczenie, oraz że struktura chromatyny jest centralną częścią procesów decydujących o profilu transkrypcyjnym komórki.
Fosforylacja histonów rdzeniowych także osłabia ich oddziaływanie z DNA. N-końcowy rejon H4 związanego z nowo powstałą chromatyną jest zarówno acetylowany jak i fosforylowany. Fosforylacji ulega również nieustrukturalizowany ogon H3. W nowopowstałych nukleosomach ufosforylowany jest także H2A (Kleinschmidt i Steinbeisser, 1991). Fosforylacja histonów może wpływać na ich wiązanie się z białkami chaperonowymi niezbędnymi w składaniu nukleosomów, może też ułatwiać łączenie się czynników transkrypcyjnym z sekwencjami regulatorowymi w nowo powstałych nukleosomach (Wolffe, 1994). Usunięcie N-końcowych ogonów histonów rdzeniowych nie zaburza tworzenia się oktameru i owijania wokół niego DNA (Böhm i inni, 1984), natomiast zwiększa dostępność DNA dla czynników transkrypcyjnych (Lee i inni, 1993). Jednocześnie chromatyna zawierająca oligonukleosomy pozbawione histonowych ogonów nie tworzy struktur wyższego rzędu, co wskazuje na udział tych fragmentów w formowaniu skomplikowanej struktury chromatyny.
Procesowi acetylacji i fosforylacji podlegają wszystkie histony rdzeniowe, ubikwitynylacja dotyczy wyłącznie białka histonu H2A. Ubikwityna przyłączana jest do H2A w pobliżu miejsca odpowiedzialnego za wiązanie się tego histonu z DNA. Transkrypcyjnie czynny gen hsp 70 u Drosophila związany jest głównie z ubikwitynylowaną formą H2A (Levinger i Varshavsky, 1982). Być może zapobiega to tworzeniu się w tym miejscu struktur chromatynowych hamujących transkrypcję.
Na różnorodność histonów rdzeniowych wpływają nie tylko potranslacyjne modyfikacje, ale także fakt występowania wielu nieallelicznych wariantów, szczególnie histonów H2A i H2B. Niektóre z wariantów H2A są ewolucyjnie konserwowane. Największą różnorodność wykazują jednak histony linkerowe. Szczególnie wyraźne zmiany wariantów tych histonów widoczne są w rozwoju niższych kręgowców. Zmiany w pierwszorzędowej strukturze H2A i H2B mogą wpływać na upakowanie DNA, powodując różnice w strukturze nukleosomu i włókna chromatynowego, oraz w sposobie wiązania linkerowego H1 z nukleosomem. Do tej pory nie wiadomo jednak dokładnie jakie znaczenie ma występowanie różnych wariantów histonowych (Wolffe, 1994).
Pozycjonowanie i mobilność nukleosomów
Histony łączą się z DNA niezależnie od jego sekwencji. Istnieją jednak sekwencje DNA z którymi histony wiążą się chętniej. Oktamer histonowy łatwiej wchodzi w oddziaływania z DNA, który ma preferencje do wyginania się (Simpson, 1991; Kropp i inni, 1995). Na pozycjonowanie nukleosomu (zajmowanie charakterystycznego położenia w stosunku do sekwencji DNA) mogą także wpływać odcinki DNA o usztywnionej strukturze, wyginające się trudniej niż sąsiadujące fragmenty (Simpson, 1991). Pozycjonowanie nukleosomów ma decydujące znaczenie dla procesu transkrypcji, decyduje o dostępności konkretnych sekwencji DNA. Położenie DNA na nukleosomie lub względem niego określane jest przez dwa parametry. Pierwszym jest ułożenie translacyjne (ang. translational positioning), które określa granice nukleosomu i decyduje o tym, które sekwencje znajdują się w linkerowym DNA, czyli DNA łączącym dwa nukleosomy. Położenie rotacyjne (z ang. rotational positioning) nukleosomu określa która strona podwójnego heliksu DNA skierowana jest ku powierzchni oktameru białkowego, która zaś na zewnątrz, czyli do otoczenia (Lewin, 1994). Oba elementy ułożenia DNA decydują o dostępności konkretnych sekwencji dla czynników transkrypcyjnych, co może mieć decydujące znaczenia dla regulacji transkrypcji u Eukaryota. Należy jednak pamiętać, że nie wszystkie nukleosomy są pozycjonowane. Wydaje się, że większość nukleosomów wykazuje mobilność, dzięki której sekwencje DNA w chromatynie są generalnie dostępne. Mobilność może być wynikiem ślizgania się nukleosomów wzdłuż DNA, lub przemieszczania nukleosomu z jednego fragmentu DNA na inny. Wciąż jednak nie wiadomo w jaki sposób podczas transkrypcji polimeraza RNA radzi sobie z nukleosomami. Studitski zaproponował model, w którym polimeraza RNA odłącza stopniowo DNA od rdzenia histonowego, ten jednak pozostaje w kontakcie z DNA, tak że po przejściu polimerazy nukleosom odtwarza się w tym samym miejscu (Studitsky i inni, 1994). Wydaje się, że oktamer stanowi całość i nie zostaje naruszony w trakcie transkrypcji (ONeil i inni, 1993; Studitsky i inni, 1994). Zwiększoną mobilność nukleosomów mogą powodować takie czynniki jak kompleks białkowy SWI/SNF z drożdży lub NURF i CHRAC z Drosophila (zob.Wstęp pkt. 2.1. i 2..2), a także niektóre czynniki transkrypcyjne jak i sama polimeraza RNA (zob. Wstęp pkt. 2.). O zmniejszeniu mobilności może z kolei decydować tworzenie represyjnych kompleksów jak Polycomb z Drosophila (zob. Wstęp. pkt. 2.5.), jednak to zjawisko nie jest zbyt dobrze zbadane.
Białka odpowiadające za powstawanie nukleosomów
Znane są białka odpowiedzialne za odkładanie nukleosomów na DNA (z ang. Nucleosome Assembly Factors). Wiadomo, że podczas replikacji rozpada się struktura nukleosomowa chromatyny. Z chwilą przejścia widełek replikacyjnych obie potomne helisy DNA zostają ponownie upakowane w strukturę nukleosomową. Do zbudowania nowych nukleosomów zużywane są zarówno histony
pochodzące ze starych nukleosomów, jak i nowo zsyntetyzowane białka. Nowopowstałe histony H3 i H4 w acetylowanej formie specyficznej dla fazy S cyklu komórkowego, odkładane są na DNA z udziałem wielobiałkowego kompleksu CAF-1 (z ang. Chromatin Assembly Factor). Następnie za pomocą białka NAP-1 (z ang. Nucleosome Assembly Protein 1) dołączane są histony H2A i H2B. Proces ten poznano u człowieka (Krude i Elgin, 1996). Na podobnej zasadzie, lecz niezależnie od replikacji, powstają nukleosomy w oocytach Xenopus laevis. Tu powstawanie struktury nukleosomowej związane jest z kwaśnymi białkami chaperonowymi. Chaperony występują w komórce w kompleksie z histonami puli matczynej i dostarczają białka histonowe do DNA syntetyzowanego we wczesnym embrionie. U Xenopus pierwszym etapem powstawania nukleosomu, czyli odkładaniem tetrameru (H3,H4)2 , kieruje białko N1 połączone z histonami H3 i H4. Za dołączenie heterodimerów (H2A,H2B) odpowiedzialna jest związana z tymi histonami nukleoplazmina (Krude i Elgin, 1996). Białka odpowiadające za powstawanie struktury nukleosomowej mogą mieć wpływ na organizację strukturalną chromatyny także w jądrze interfazowym, szczególnie że zarówno białko NAP-1 człowieka jak i nukleoplazmina Xenopus mają zdolność odłączania heterodimerów (H2A,H2B) od nukleosomów.
Z przedstawionych danych wynika, że w komórkach eukariotycznych procesy decydujące o regulacji ekspresji genów są nierozerwalnie związane z nukleosomami i tym samym ze strukturą chromatyny.
TRANSKRYPCJA NA MATRYCY CHROMATYNOWEJ
W latach 60, gdy niewiele wiedziano o regulacji ekspresji genów u organizmów eukariotycznych, a nukleosomowa struktura chromatyny nie była jeszcze odkryta, histony były najlepszymi kandydatami do funkcji regulatorów transkrypcji, choć nie było jasne w jaki sposób mogą specyficznie wpływać na regulację aktywności genów. Kiedy ustalono, że tworzą białkową część podstawowej jednostki strukturalnej chromosomu oraz gdy pojawiły się informacje na temat sekwencji regulatorowych (regulacja cis) i czynników aktywujących (regulacja trans), histony jako specyficzne regulatory genów poszły w niepamięć. Jednak fakt upakowania DNA w struktury nukleosomowe oraz występowanie indukowanych przez histon H1 wyższego rzędu włókien chromatyny, tzw. włókien 30 nm stanowi poważny problem przestrzenny, który musi być w jakiś sposób uwzględniony w trakcie inicjacji i elongacji transkrypcji. Problem ten zaczął stawać się coraz ciekawszy w miarę jak pojawiały się dane o histonach związanych z DNA aktywnych transkrypcyjnie genów. Obecnie wiadomo, że struktura chromatyny zawierającej geny o wysokim poziomie transkrypcji (tzw. euchromatyna) różni się od chromatyny, w której transkrypcja nie zachodzi (tzw. heterochromatyna). Wiadomo również, że struktura chromatyny genu w momencie aktywacji transkrypcji zmienia się w stosunku do struktury chromatyny genu wyciszonego. Wpływ na zmianę ułożenia w stosunku do DNA histonów rdzeniowych jak i prawdopodobnie histonu H1 (związanego zarówno z histonami rdzeniowymi jak i DNA owiniętym wokół nukleosomu), a tym samym na zmianę dostępności DNA dla czynników transkrypcyjnych, mają niedawno odkryte kompleksy białkowe (Stern i inni, 1984., Breeden i Nasmyth 1987, Winston i Carlson 1992). Znane są także kompleksy białkowe o funkcji przeciwstawnej. Stabilizują one histony na DNA, wspomagają tworzenie się struktur wyższego rzędu i tym samym uniemożliwiają dostęp czynnikom transkrypcyjnym do promotorów i sekwencji regulatorowych znajdujących się w kontrolowanym przez nie obszarze chromatyny. W konsekwencji transkrypcja aktywnych wcześniej genów zostaje wygaszona (Kingston i inni, 1996). W trakcie ostatnich kilku lat zidentyfikowano wiele czynników białkowych potrzebnych do aktywacji i represji genów. Okazuje się, że niektóre z tych białek tworzą duże kompleksy, które oddziałują z nukleosomami powodując stabilizację (represory) lub destabilizację (aktywatory) struktury chromatyny, co prowadzi odpowiednio do represji lub aktywacji procesu transkrypcji. Scharakteryzowanie tych kompleksów jest niezbędne do zrozumienia mechanizmu ogólnej regulacji ekspresji genów, który jest procesem nadrzędnym nad specyficznym oddziaływaniem czynników transkrypcyjnych bezpośrednio zaangażowanych w transkrypcję konkretnych genów. Szczególnie ważne jest zrozumienie regulacji genów związanych z rozwojem organizmu. Wiele białek budujących wspomniane wyżej kompleksy zostało zidentyfikowanych dzięki badaniom nad molekularnym podłożem mutacji wpływających na takie procesy jak zmiana typu koniugacyjnego drożdży, segmentacja ciała u Drosophila czy neoplazja u ssaków (Stern i inni, 1984., Kenison i Tamkun 1988., Haupt i inni 1992, van Lohuizen i inni 1991.).
Na jakie procesy decydujące o ekspresji genów w komórkach eukariotycznych może mieć wpływ struktura chromatyny? Niewątpliwie kluczowym procesem jest tu wiązanie się czynników białkowych ze znajdującymi się w strukturze chromatynowej obszarami promotora i enhancera genu. Można przyjąć w uproszczeniu, że transkrypcja wygląda następująco: na początku następuje przyłączenie aktywatorów transkrypcji, następnie uformowanie przez ogólne czynniki transkrypcyjne aktywnego kompleksu preinicjacyjnego, w końcu inicjacja i elongacja transkrypcji przez polimerazę RNA. W badaniach in vitro wykazano, że nukleosomy wywierają hamujący wpływ na każdy z wymienionych wyżej etapów. Istotne są również dane wskazujące że przyłączenie linkerowego histonu H1 prawie całkowicie wyklucza zajście transkrypcji in vitro (Lorch i inni, 1987, Kamakaka i inni, 1993, Felsenfeld 1992, Adams i Workman 1993). Można sobie zatem wyobrazić, że kompleksy aktywatorowe tak zmieniają strukturę chromatyny, że zajście wszystkich etapów transkrypcji zostaje ułatwione, podczas gdy represory stabilizują włókna chromatynowe wspomagając tworzenie struktur wyższego rzędu i tym samym uniemożliwiają zorganizowanie kompleksu transkrypcyjnego na matrycy chromatynowej.
W początkach lat 90. nowe dane genetyczne i biochemiczne dostarczyły dowodów, że w komórkach istnienieją czynniki destabilizujące strukturę chromatyny w sposób, który ułatwia aktywację transkrypcji. W 1991 roku Durrin i wsp. (Durrin i inni, 1991) odkryli mutację w histonie H4, hamującą aktywację genów GAL1 i PHO5 u S.cerevisiae, co wskazywało że czynniki aktywujące oddziałują wprost z histonami. Stwierdzono, że dodanie czynników destabilizujących strukturę nukleosomów do matrycy chromatynowej w bezkomórkowych systemach do transkrypcji in vitro z drożdży, z muszki owocowej, a także tkanek ssaczych, znacząco obniża represję transkrypcji przez nukleosomy (Workman i inni, 1988, Lorch i inni, 1992, Kamakaka i inni, 1993). Doniesienia te zainspirowały badaczy do poszukiwania w różnych organizmach czynników zmieniających strukturę chromatyny i w ten sposób wspomagających inne białka zaangażowane w aktywacji transkrypcji.
Kompleks białkowy SWI/SNF z S.cerevisiae.
Czynnikami posiadającymi wyżej opisane właściwości są białka kodowane przez grupę genów nazwaną SWI/SNF u S.cerevisiae (Winston i Carlson, 1992). Geny SWI są niezbędne do prawidłowej regulacji zmian typu koniugacyjnego drożdży (Stern i inni, 1984, Breeden i Nasmyth, 1987). Udowodniono, że geny SWI1, SWI2 i SWI3 są niezbędne do niezaburzonej transkrypcji niektórych genów
drożdżowych np. genu HO (endonukleaza wymagana do zmiany typu koniugacyjnego), INO1 (enzym wymagany w metabolizmie inozytolu), SUC2 (inwertaza wymagana do wzrostu na sacharozie i rafinozie) (Peterson i Herskowitz, 1992). Do transkrypcji SUC2 okazały się także potrzebne geny z grupy SNF (Neigeborn i Carlson, 1984). Geny SNF2, SNF5 i SNF6 są również niezbędne do normalnej transkrypcji z udziałem sekwencji LTR (Long Terminal Repat) retrotranspozonu Ty (Happel i inni, 1991). Stwierdzono, że gen SNF2 jest identyczny z genem SWI2. Kolejne badania genetyczne wskazywały, że produkty genów SWI/SNF mogą tworzyć kompleks białkowy, który w aktywny sposób prowadzi do destabilizacji struktury chromatyny. Znaleziono mutanty drożdżowe SIN, w których zidentyfikowano supresory mutacji swi-. Okazało się, że mutacje sin1 i sin2 są zdolne do częściowej supresji mutacji w genach SWI1, SWI2 oraz SWI3 (Sternberg i inni, 1987, Kruger i inni, 1995). Stwierdzono, że mutacja sin2-1 leży w genie HHT1, który koduje histon H3. Znaleziono sześć dalszych mutacji punktowych, z których trzy lokują się w histonie H3 i trzy w histonie H4 , które suprymują efekt braku kompleksu SWI/SNF (Kruger i inni, 1995). Mutacje te ulokowane są w miejscach odpowiedzialnych za kontakt histon-histon w oktamerze nukleosomu i za wiązanie histonów z DNA. Każda z opisanych mutacji może obniżać stabilność nukleosomów. Z kolei gen SIN1 koduje białko homologiczne do białka HMG1, które wchodzi w skład białek chromatynowych. Mutacja sin1 zaburza segregację chromosomów, co wskazuje że produkt genu SIN1 bierze udział w tworzeniu chromatyny (Kruger i Herskowitz, 1991). Nie tylko zmiany w histonach H3 i H4 suprymują fenotypy swi/snf, także obniżenie ilości histonów H2A i H2B w komórce daje podobny efekt (Hirschorn i inni, 1992). Należy więc przyjąć, że zmiany we wszystkich występujących w komórkach drożdżowych histonach H3, H4, H2A i H2B, oraz zmiany w innych białkach strukturalnych chromatyny, wyrażają się w częściowej supresji mutacji swi/snf. Pamiętając o tym, że produkty genów SWI i SNF tworzą kompleks niezbędny do normalnej transkrypcji niektórych genów drożdżowych, a destabilizacja struktury chromatyny suprymuje fenotypy swi/snf, nasuwa się wniosek, że kompleks SWI/SNF oddziałuje z białkami chromatyny, destabilizuje jej strukturę i tym samym ułatwia dostęp do DNA dla czynników transkrypcyjnych. Po oczyszczeniu kompleksu aktywatorowego SWI/SNF okazało się, że zawiera on 11 podjednostek. Są nimi białka kodowane przez geny SWI1, SWI2/SNF2, SWI3, SNF5, SNF6 i niedawno zidentyfikowany SNF11 (Cairns i inni, 1994; Côte i inni, 1994; Treich i inni, 1995). Wcześniej wykazano, że kompleks aktywatorowy ma aktywność ATP-azy zależnej od DNA i tylko w obecności ATP jest w stanie zmieniać strukturę chromatyny (Laurent i inni, 1993; Côte i inni, 1994). SWI/SNF wiąże się in vitro z przecinającymi się nićmi DNA (co przypomina ułożenie DNA w miejscu gdzie z jednej strony wchodzi on, a z drugiej opuszcza nukleosom) i indukuje powstawanie pozytywnych superskrętów w nagim plazmidzie (Quinn i inni, 1996). Obie te aktywności mogą odgrywać rolę w destabilizacji nukleosomu, choć żadna z nich nie jest związana z ATP. Nie tylko w drożdżach odkryto aktywności zmieniające strukturę nukleosomową. Wyizolowano ludzkie geny homologiczne do drożdżowych SWI2/SNF2. Nazwano je Brg1 i hBrm ze względu na ich podobieństwo do pochodzących z muszki owocowej genów Brahma, również homologów SWI2/SNF2 ( Kennison i Tamkun, 1988; Tamkun i inni, 1992; Khavari i inni, 1993; Muchardt i Yaniv 1993 ). Stwierdzono, że produkty tych genów mają aktywność ATP-az oraz powodują dysrupcję struktury chromatyny ( Imbalzano i inni, 1994; Kwon i inni, 1994 ). Dostępne dane wskazują, że zależna od ATP dysrupcja struktury chromatyny jest ewolucyjnie konserwowaną funkcją kompleksu SWI/SNF. Najprawdopodobniej ułatwia on wiązanie się czynników transkrypcyjnych do DNA. Jeśli tak jest struktura chromatyny musi mieć związek z regulacją aktywności genów. Powstaje jednak pytanie w jaki sposób kompleksy białkowe dostają się w pobliże genu którego strukturę mają zmienić. Niedawno okazało się, że kompleks SWI/SNF jest związany z holoenzymem polimerazy II RNA i w ten sposób może być kierowany do miejsca swego działania (Sthrul, 1996). Pojawia się jednak następne pytanie: dlaczego kompleks SWI/SNF wpływa na aktywację tylko niewielkiej grupy genów, skoro jest związany z holoenzymem polimerazy II RNA, od którego zależy ekspresja większości genów. Odpowiedź na to pytanie nie jest jak dotąd znana.
Kompleksy białkowe NURF i CHRAC z Drosophila
Badania prowadzone na muszce owocowej doprowadziły do odkrycia innego kompleksu białkowego zwanego NURF (z ang. Nucleosome Remodeling Factor), który podobnie jak SWI/SNF wpływa w sposób zależny od ATP na strukturę chromatyny, wspomaga in vitro efekt GAGA czynnika wiążącego się z DNA (Tsukijama i Wu, 1995). Analiza genetyczna doprowadziła do zidentyfikowania produktu genu ISWI (ang. imitation switch), jako jedną z podjednostek kompleksu NURF (Tsukijama i inni, 1995). Gen ISWI wykazuje podobieństwo sekwencji do drożdżowego SWI2/SNF2 (Elfring i inni, 1994). U Drosophila występuje wspomniany już wyżej gen Brahma (Brm), którego homologia z genem SWI2/SNF2 jest wyższa niż genu ISWI. Warto podkreślić, że podobieństwo ISWI z SWI2/SNF2 dotyczy głównie sekwencji kodującej domenę decydującą o aktywności ATP-azy. U człowieka znaleziono gen hSNF2 (Okabe i inni, 1992), który jest w 75% homologiczny z genem ISWI z Drosophila. Kompleks NURF jest najprawdopodobniej wysoce konserwowany, o czym świadczy występowanie u drożdży analogicznego do ISWI genu YB95 (Tsukijama i inni, 1995).
Są już doniesienia o odkryciu kolejnego kompleksu białkowego, który może decydować o strukturze chromatyny. Kompleks CHRAC ( ang. Chromatin Accesibility Compleks), odmienny od dwóch poprzednio opisanych kompleksów, zwiększa dostępność DNA dla czynników transkrypcyjnych (Krude i Elgin, 1996). Powracając do pytania postawionego wcześniej, dlaczego kompleks SWI/SNF oddziałuje na strukturę promotorów tylko niektórych genów, można zaryzykować odpowiedź, że w komórce istnieje wiele kompleksów decydujących o strukturze chromatyny, które z niejasnych dotąd powodów i działają w stosunku do różnych genów.
Czynniki transkrypcyjne wpływające na zmianę struktury chromatyny.
Poza wspomnianymi wyżej kompleksami białkowymi wpływającymi na aktywność transkrypcji poprzez zmianę struktury chromatyny istnieją specyficzne białka będące aktywatorami transkrypcji, działające pojedynczo i wyłącznie na matrycę chromatynową. Do takich białek należą czynnik GAGA z Drosophila i białko ssacze LEF-1. Czynnik GAGA jest niezbędny do ustalenia odpowiedniej struktury nukleosomowej na promotorach genów HSP26 i HSP70 podczas ich aktywacji transkrypcyjnej (Lis i Wu, 1993 ). Jak wspomniano wcześniej ten czynnik może współdziałać z kompleksem NURF (Tsukijama i inni, 1994; Tsukijama i Wu, 1995), oraz znosić represyjne działanie histonu H1 w układzie do transkrypcji in vitro. Z kolei LEF-1 ma zdolność do wyginania DNA. Uważa się że wpływając na architekturę DNA stanbilizuje on strukturę sprzyjającą aktywnej transkrypcji (Geise i inni, 1992). Zarówno czynnik GAGA z Drosophila jak i ssaczy czynnik LEF-1 nie stymulują transkrypcji z nagiego DNA, działają tylko z matrycą chromatynową. Pozostaje ustalić czy do ich oddziaływań z chromatyną niezbędne są szczególne domeny białkowe, a jeśli tak, to czy są one podobne do znanych już domen specyficznych czynników transkrypcyjnych. Jeśli przeorganizowanie chromatyny jest niezbędne do aktywacji genów u Eukariota, można przypuszczać, że istnieją specyficzne domeny charakterystyczne dla białek oddziałujących z chromatyną i zdolnych do dokonywania zmian w jej strukturze.
Multimeryczne kompleksy białkowe decydujące o represji transkrypcji genów
Liczba genów biorących udział w aktywacji ekspresji genów poprzez zmiany w strukturze chromatyny jest coraz większa. Wydaje się, że równie liczne są białka oddziałujące na chromatynę i decydujące o represji genów. Zachowanie stanu represji jest szczególnie ważne u organizmów wielokomórkowych, w których geny odpowiedzialne za rozwój, stan zróżnicowania tkankowego mogą być aktywne tylko w niektórych rodzajach komórek..
Kompleks białek Polycomb u Drosophila.
Grupę genów Polycomb (Pc-G). odkryto u Drosophila w 1947 roku. Geny grupy Pc-G zidentyfikowano jako represory genów homeotycznych. Badano mutacje, których efekty wyglądały jak spowodowane przez mutacje w genach homeotycznych, jednak okazało się, że dotyczą one genów Polycomb. Produkty tych genów tworzą multimeryczne kompleksy białkowe i uważane są dziś za podstawowe elementy pamięci komórkowej. W skład rodziny Pc-G wchodzi około 30-40 genów. Do tej pory poznano 13 z nich (Simon, 1995). Badania biochemiczne i doświadczenia z hybrydyzacją in situ wykazały, że geny Polycomb tworzą kilka dużych kompleksów. Produkty genów z rodziny Pc-G, a mianowicie Pc (Polycomb), Pcl (Polycomb like), Ph (polyhomeotic) zlokalizowane są w tych samych miejscach na chromosomach politenicznych (Zink i Paro, 1989; DeCamillis i inni, 1992; Franke i inni, 1992; Lonie i inni, 1994). Produkty genów Psc (Posterior sex combs) i Su(2)Z (Suppressor 2 of zeste) wiążą się do chromosomów w tych samych miejscach co Pc, Pcl i Ph, ale występują także w innych miejscach chromatyny (Rastelli i inni, 1993). Na poziomie molekularnym scharakteryzowano trzy geny z grupy Polycomb : Pc, Ph oraz Psc. Wielkość genu Pc wynosi 4 kb. Koduje on białko o masie 44 kDa (Paro i Hognes, 1991). Białko Pc zawiera konserwowaną ewolucyjnie chromodomenę. Motyw ten występuje w białku Drosophila HP1 specyficznie związanym z heterochromatyną (Paro i Hogness, 1991), jak i w białkach mysich M31, M32 i CHD-1. Pomimo wyraźnego związku z chromatyną białko Pc nie ma zdolności wiązania się z DNA. Przypuszcza się, iż działa w powiązaniu z innymi czynnikami. Produkt genu Pc pozbawiony chromodomeny jest nieaktywny. Białka Ph i Psc mają motywy wiążące się z DNA (DeCamillis i inni, 1992; Brunk i inni, 1991), domeny te nie są jednak niezbędne do działania tych białek. Wiadomo, że białko Pc jest rozmieszczone równomiernie we wszystkich tkankach, choć największa liczba cząsteczek znajduje się w dyskach imaginalnych i silnie proliferującej tkance nerwowej tworzącej zaczątek ośrodkowego układu nerwowego (Paro i Zink, 1992; Messmer i inni, 1992).
Wczesny wzór ekspresji genów homeotycznych w dzikich zarodkach Drosophila i w zarodkach posiadających mutacje w genach Pc-G jest identyczny. Oznacza to, że produkty Pc-G nie są zaangażowane w wytworzenie wzoru ekspresji genów homeotycznych, lecz w jego utrzymanie (Simon i inni, 1992). Według jednej z koncepcji białka Polycomb rozpoznają nieaktywny transkrypcyjnie gen homeotyczny i utrzymują w sposób dziedziczny wytworzony stan represji (Calikowski, 1996). Byłyby więc one jednym z elementów dziedziczenia epigenetycznego. Badania nad jednym z genów Pc-G , E(z) (Enhancer of Zeste) dostarczyły bezpośrednich dowodów na wpływ białek represyjnych na strukturę chromatyny (Rastelli i inni, 1993). Odkryto termowrażliwą mutację E(z), która powoduje że, w temperaturze 29oC następuje inaktywacja białka. Zaobserwowano rozluźnienie struktury chromosomów politenicznych u larw wspomnianego wcześniej mutanta Drosophila hodowanych w tej temperaturze, jak również rozpad kompleksu Pc-G i odłączenie białek Psc, Ph i Pc od genów docelowych. Świadczy to o bezpośrednim wpływie kompleksów represyjnych na organizację chromatyny. Poznano sekwencje położone w sąsiedztwie rejonu genów homeotycznych PREs (ang. Pc-G Response Elements), które są odpowiedzialne za przyłączanie się kompleksu Pc-G do tego rejonu genów homeotycznych. Do tej pory nie wiadomo w jaki sposób sekwencje PREs są rozpoznawane i jak łączą się z nimi białka kompleksu Pc-G. Jak wspomniano żadne z białek Polycomb nie łączy się specyficznie z DNA (Kingston i inni, 1996). Raz wytworzony kompleks Pc-G utrzymuje represję genów homeotycznych przez wiele podziałów komórkowych, najprawdopodobniej poprzez ustalenie dziedziczonej epigenetycznie represyjnej struktury chromatyny. Do tej pory nie znany jest mechanizm tworzenia się takiej struktury. Nie istnieje system in vitro, w którym możnaby wykazać tworzenie się wyższych struktur chromatyny pod wpływem działania Pc-G, nie wiadomo także czy którekolwiek z białek Polycomb oddziałuje z nukleosomami. Zaproponowano dwa modele przedstawiające mechanizm represji genów przez kompleksy Pc-G. Według pierwszego z nich rolą tych kompleksów byłoby tworzenie w chromatynie struktur wyższego rzędu a początkiem formowania się takiej struktury miałyby być sekwencje PREs. Wewnątrz tak zestrukturalizowanej chromatyny ukryte byłyby enhancery i sekwencje regulatorowe rozpoznawane przez czynniki transkrypcyjne. Drugi model zakłada istnienie przedziałów wewnątrzjądrowych utworzonych przez kompleksy Polycomb; sekwencje PREs służyłyby jako punkty przyczepienia chromatyny do białek Pc-G. Im większy obszar DNA wchodzi w skład takiego przedziału tym silniejsza jest represja transkrypcji. Na poparcie tej teorii można przytoczyć fakt skupienia genów homeotycznych w bloki na chromosomach, co ułatwiałoby tworzenie wraz z multimerycznymi kompleksami represyjnymi przedziałów wewnątrzjądrowych (Paro, 1993). Nie tylko u Drosophila wykryto multimeryczne kompleksy białkowe wpływające na represję transkrypcji z matrycy chromatynowej. U ssaków znane są homologi genów Psc i Su(2)z. Są nimi mysi gen bmi-1 i ludzki Bmi-1 (van der Lugt i inni, 1994). Gen Bmi-1 uważany jest za protoonkogen współdziałający z białkiem Myc. Zaburzenia ekspresji genu bmi-1 u myszy prowadzą do powstania różnego rodzaju anomalii rozwojowych (Alkema i inni, 1995).
Mechanizmy represji genów u S.cerevisiae związane ze strukturą chromatyny.
Mechanizmy represji transkrypcji związane z ustaloną strukturą chromatyny poznano najlepiej u drożdży. W trakcie badań nad zmianami typów koniugacyjnych u drożdży okazało się, że regulacja ekspresji genów odpowiedzialnych za prawidłowe zajście tego procesu zależy od struktury chromatyny, a bezpośrednio od histonów H3 i H4. Wykazano, że represja transkrypcji genów w obszarach SML
(ang. Silent Mating Loci) i w okolicach telomerów zachodzi w podobny sposób.
Wyciszanie ekspresji genów w okolicy telomerów również zależy od histonów H3 i H4, a także od białek SIR3 i SIR4 (ang. Silent Information Regulator) bezpośrednio oddziałujących z N-końcami obu wspomnianych histonów oraz od białek RAP1 i kompleksu ORC (z ang. Origin Recognition Complex). RAP1 wiąże się specyficznie z sekwencjami DNA w okolicach telomerowych. Kompleks ORC łączy się w miejscach startu replikacji W DNA (Kingston i inni, 1996). Mechanizm represji związanej z telomerami nie jest do końca poznany. Przypuszcza się, że w tę regulację zaangażowane są jeszcze inne czynniki. Nie jest jasne które z podanych białek tworzą stabilny kompleks, a które odpowiedzialne są za ukierunkowanie procesu represji. Nie wiadomo także jaka jest rola kompleksu ORC, i jak istotna jest rola replikacji w wyciszaniu ekspresji genów (Kingstn i inni, 1996). Nie ulega jednak wątpliwości, że to struktura chromatyny ma podstawowe znaczenie w procesie represji genów. Uważa się, że większość opisanych wyżej mechanizmów zapewnia nieodwracalny i dziedziczny stan represji.
Inny system represji związany jest z białkami SSN6 i TUP1. Wpływają one na represję takich genów jak SUC2, Gal1/Gal10 i genów niezbędnych do syntezy czynnika a (geny reprymowane w komórkach drożdży typu ?). Represja jest związana ze zmianą struktury nukleosomowej i może być znoszona w odpowiednich warunkach wzrostu (Johnson, 1995; Roth, 1995). Ani białko SSN6 ,ani TUP1 nie mają zdolności wiązania z DNA. Uważa się, że mogą oddziaływać na represję poszczególnych genów dzięki innym białkom bezpośrednio związanym z DNA np. ?2/MCM1 (Johnson, 1995). We wszystkich przypadkach represji przez białka SSN6 i TUP1 ułożenie nukleosomów na genach wykazuje określony porządek, natomiast po zniesieniu represji ich ułożenie całkowicie się zmienia ( Roth i inni, 1990; Shimizu i inni, 1991; Axelrod i inni, 1993; Cavalli i Thoma, 1993, Cooper i inni. 1994; Hirschhorn i inni, 1995). Wykazano, że zarówno pozycjonowanie nukleosomów na DNA jak i sama represja genów znoszone są przez mutacje w N-końcowej części histonu H4, oraz że białko TUP1 oddziałuje z ogonami histonów H3 i H4 (Edmondson i inni, 1996).
Nukleosomy stymulują transkrypcję
Zdarza się, że nukleosomowa struktura chromatyny podnosi wydajność procesu transkrypcji. Ciekawym przykładem jest promotor vitellogeniny B1 Xenopus. W tym przypadku nukleosom związany jest pomiędzy enhancerem i miejscem wiązania dla czynnika transkrypcyjnego HNF3 (ang. Hepatocyte Nuclear Factor 3) i czynnika jądrowego NF1. Powoduje to powstawanie pętli w DNA i zbliżenie
enhancera transkrypcji i obszaru promotorowego, co w rezultacie stymuluje proces transkrypcji (Schild, 1993).
BIOLOGICZNA FUNKCJA HISTONU H1
Struktura domeny wiążącej H1 do elementów powierzchni rdzenia nukleosomu (najbardziej eksponowanymi elementami tej powierzchni są środkowy i dwa boczne heliksy DNA) jest silnie konserwowana i co ciekawe, silnie przypomina strukturę domeny wiążącej DNA czynnika transkrypcyjnego HNF-3 (Clark i inni, 1993). Warto podkreślić, że to podobieństwo może nie być zupełnie przypadkowe. Histon H1 nie ma typowej dla histonów rdzeniowych domeny zwinięcia histonowego (histone fold), która została uznana za najstarszą ewolucyjnie (występuje już w pra-histonach u Archebacteriae) determinantę strukturalną wyznaczającą funkcję kompleksu histonowego w stosunku do DNA (Arents i Moudrianakis, 1995). Z punktu widzenia struktury białkowej H1 nie jest typowym histonem, co jest zresztą w zgodzie z faktem, że jego ułożenie i relacja w stosunku do DNA w chromosomie są zupełnie odmienne od ułożenia i relacji charakteryzujących histony rdzeniowe (zob. pkt.1.1). Nie można wykluczyć możliwości, że H1 jest w istocie dawnym czynnikiem transkrypcyjnym, który na skutek ewolucyjnych adaptacji zaczął pełnić dodatkową rolę elementu strukturalnego chromosomów. Na czym miałaby polegać ta rola ?
H1 jest ogólnym represorem transkrypcji w układach in vitro
Badania w układzie do transkrypcji in vitro wykazują, że H1 jest ogólnym represorem transkrypcji zarówno w przypadku, gdy matrycą jest nagi DNA (transkrypcja przez polimerazę RNA z E.coli), jak i w przypadku matryc chromatynowych, z których uprzednio usunięto H1 (transkrypcja przez polimerazę II RNA z grasicy cielęcej) (Hannon i inni, 1984).
Histon H1 in vivo jest specyficznym represorem transkrypcji niektórych klas genów (5S RNA)
Najlepiej poznanym przykładem działania H1 jako represora specyficznego jest regulacja transkrypcji genów 5SRNA w trakcie rozwoju embrionalnego u Xenopus laevis (Wolffe, 1994). W początkowych etapach rozwoju embrionalnego u Xenopus transkrypcji ulegają dwie rodziny genów 5SRNA: geny 5S typu oocytarnego i geny 5S typu somatycznego. Po przejściu stadium późnej gastruli transkrypcja genów oocytarnych ulega zahamowaniu, podczas gdy transkrypcja genów somatycznych zachodzi nadal i trwa nieprzerwanie w ciągu całego okresu życia organizmu. Początkowe badania nad transkrypcją genów 5SRNA in vitro wykazały, że do represji transkrypcji genów typu oocytarnego niezbędna jest obecność somatycznego histonu H1 (Schlisel, 1984). Ten wariant H1 pojawia się w trakcie rozwoju embrionalnego na etapie późnej gastruli. Dane te są w zgodzie z wynikami badań nad rozwojem Xenopus. Podczas wczesnej embriogenezy u Xenopus stopniowo nagromadzany jest somatyczny histon H1. Równolegle zachodzi wyciszanie ekspresji oocytarnych genów 5SRNA (Smith, 1988; Dworkin-Rastl, 1994). Doświadczenia, w których wyłączano ekspresję somatycznego histonu H1 w początkowych fazach rozwoju żaby, potwierdziły w sposób jednoznaczny rolę H1 w regulacji transkrypcji genu oocytarnego 5SRNA. Nieobecność somatycznego H1 powoduje, że transkrypcja oocytarnych genów 5SRNA przebiega bez zakłóceń także po stadium gastrulacji (Bouvet i inni, 1994; Kandolf, 1994). Różnica pomiędzy oocytarnymi a somatycznymi genami 5SRNA dotyczy przede wszystkim sekwencji DNA, które otaczają te geny. Po obu stronach genu oocytarnego znajdują się obszary DNA bogate w pary AT. Natomiast gen somatyczny otaczają sekwencje bogate w pary GC. W badaniach in vitro wykazano, że zamiana sekwencji otaczających pomiędzy genami obu typów powoduje represję przez H1 transkrypcji genu somatycznego uwalnia natomiast od represji przez H1 transkrypcję genu oocytarnego. Wykazano następnie, że przyczyną takiego efektu H1 jest jego selektywne wiązanie się z sekwencjami AT-bogatymi, które stanowią naturalne otoczenie genu oocytarnego 5SRNA (Jerzmanowski i Cole, 1990). Dalsza analiza wykazała istnienie charakterystycznych różnic w strukturze chromatyny badanych genów. W obszarze chromatyny obejmującym geny oocytarnego 5SRNA nukleosomy zajmują stabilne pozycje na DNA, natomiast w obszarze, w którym znajdują się geny somatyczne nukleosomy mogą się swobodnie przesuwać po DNA. Geny oocytarne 5SRNA znajdują się w strukturze nukleosomowej, podczas gdy chromatyna większości genów somatycznych 5SRNA jest wolna od nukleosomów. Wykazano, że histon H1 aktywnie wpływa rodzaj struktury chromatyny w obszarze genów 5SRNA (Chipev, 1992). Potwierdziło to dane na temat represyjnego efektu histonu H1 na transkrypcję oocytarnych genów 5SRNA, nie wyjaśniło jednak dotychczas dokładnego mechanizmu działania H1. Niedawno Tomaszewski i Jerzmanowski w badaniach in vitro, ustalili, że sekwencje bogate w AT otaczające oocytarne geny 5SRNA stanowią silny sygnał, który indukuje zależną od H1 reorganizację chromatyny w obszarze badanych genów. Wynikiem oddziaływania histonu H1 z sekwencjami bogatymi w AT w chromatynie rekonstytuowanej in vitro, jest zwiększenie odległości międzynukleosomowej i częściowa stabilizacja rozmieszczenia nukleosomów. Pozycjonowane nukleosomy chronią gen oocytarnego 5SRNA i powodują represję jego transkrypcji w układzie in vitro. Podobny efekt histonu H1, nie występuje w przypadku rekonstytucji chromatyny zawierającej somatyczne geny 5SRNA, które pozbawione są bogatych w AT sekwencji oskrzydlających (Tomaszewski i Jerzmanowski, 1997).
Histon H1 jest ważnym elementem zapewniającym regularność wyższego rzędu struktur chromatyny
W jądrze komórkowym, w fizjologicznych warunkach stężenia soli, chromatyna występuje w postaci struktury wyższego rzędu, zwanej włóknem 30 nm. W 1979 Thoma i współpracownicy roku przedstawili model budowy tej struktury. Miałaby ona powstawać na skutek spiralizacji podstawowego włókna nukleosomowego prowadzącej do utworzenia regularnej, pustej w środku cewki, w której na jeden skok spirali przypada 6 nukleosomów. Ten model jest wciąż uznawany, choć przedstawione przez autorów założenia nie są zgodne z niektórymi wynikami późniejszych doświadczeń (Van Holde i Zlatanowa, 1996). Wiadomo, że włókno 30 nm jest naturalną postacią chromatyny w jądrze interfazowym. Dane z badań in vitro wykazują, że nawet przy braku histonu H1, w odpowiednim stężeniu soli możliwe jest powstawanie wyższego rzędu struktur chromatyny. Ich budowa nie odpowiada jednak regularnej strukturze włókna 30 nm powstającego w naturalnych warunkach. A zatem histon H1 umożliwia, prawdopodobnie dzięki neutralizacji ładunków, odpowiednie zwinięcie chromatyny w regularne włókna 30 nm (Van Holde i Zlatanowa, 1996).
Histon H1 występuje w postaci wyraźnych wariantów sekwencyjnych, różniących się siłą oddziaływania z DNA, przy czym u zwierząt warianty te pojawiają się w charakterystycznej kolejności podczas embriogenezy
U wyższych eukariontów histon H1 występuje w postaci wielu nieallelicznych wariantów sekwencyjnych. Poszczególne warianty różnią się strukturą pierwszorzędową, ale ich ogólny plan budowy pozostaje ten sam. Podczas rozwoju embrionalnego ekspresja poszczególnych wariantów podlega ścisłej regulacji. Izoformy histonu H1 pojawiające się w trakcie rozwoju u zwierząt podzielono na cztery grupy: 1. cleavage linker histones (CS) - geny histonów tej grupy ulegają transkrypcji tylko podczas oogenezy i wczesnej embriogenezy; 2. somatyczne histony linkerowe - histony tej grupy występują w chromatynie większości komórek somatycznych; 3. histony tkanek terminalnie zróżnicowanych - histony te występują w komórkach nie dzielących się, całkowicie zróżnicowanych. Oprócz wymienionych grup, wyróżnia się dodatkowo wariant zwany H1t, specyficzny dla komórek spermatogennych z jąder kręgowców.
Regulację ekspresji wariantów H1 w rozwoju poznano najlepiej u jeżowca. Jako pierwszy pojawia się w rozwoju jeżowca histon CS (cleavage stage) pochodzenia matczynego, który bierze udział w formowaniu chromatyny embrionalnej. Gdy embrion osiąga stadium 16-komórkowe, białko CS zastępowane jest przez histony ? (early histones), które powstają w wyniku translacji matczynego RNA. W stadium blastuli histony ? zanikają, a ich miejsce zajmują późne histony H1 (Davidson, 1986).
Histony Cs kręgowców poznano najlepiej u Xenopus laevis. Wczesny wariant H1 u Xenopus nazwano B4. Nagromadzany jest on w trakcie oogenezy. Po zapłodnieniu, aż do stadium gastruli jest wariantem dominującym, choć poziom jego mRNA zaczyna spadać już od przejścia stadium środkowej blastuli, czyli w momencie rozpoczęcia ekspresji genów zygotycznych. W fazie środkowej blastuli rozpoczyna się ekspresja somatycznych histonów łącznikowych: H1A, H1B i H1C (ze zmianą wariantów histonów H1 związana jest opisana wyżej regulacja ekspresji genów oocytarnych 5SRNA), która zachodzi we wszystkich komórkach organizmu. U ssaków nie znaleziono dotychczas histonów H1 z grupy CS. Natomiast ustalono, że na przykład u myszy grupę somatycznych histonów łącznikowych tworzy aż 5 wariantów (H1a, H1b, H1c, H1d, H1e). Z kolei u kręgowców poznano dwa warianty histonów tkanek terminalnie zróżnicowanych: histon H1o u ssaków (Panyim i Chalkey, 1969) i H5 u ptaków. Ekspresja genu H5 jest ograniczona wyłącznie do erytrocytów, u których chromatyna wykazuje wysoki stopień kondensacji i następuje zahamowanie transkrypcji większości genów (Affolter i inni, 1987).
Dotychczasowe badania nad wariantami sekwencyjnymi wykazują, że: a. pojawiają się one w określonych momentach rozwoju organizmu; b. wykazują pewną specyficzność tkankową (Risley i Eckhardt, 1981; Bers i inni, 1992); c. różnią się rozmieszczeniem w chromatynie i skondensowanych chromosomach (Hoyer-Fender i Grossbach, 1988; Mohr i inni, 1986; Bers i inni, 1992; Breneman i inni 1993); d. posiadają różną zdolność do kondensowania chromatyny (Liao i Cole, 1981a; Liao i Cole, 1981a); e. posiadają określone preferencje w stosunku do sekwencji DNA (Liao i Cole, 1981; Liao i Cole, 1981a); f. wpływają w różny sposób na stopień metylacji DNA (Strom i inni, 1995). Wszystkie te cechy wskazują, że różnorodność podtypów histonów łącznikowych może mieć istotną funkcję regulacyjną, w szczególności może współdecydować o stanie aktywności transkrypcyjnej komórki.
Histon H1 podlega intensywnym modyfikacjom potranslacyjnym
Histon H1 jest modyfikowany potranslacyjnie na kilka sposobów. Najważniejszymi modyfikacjami H1 są: fosforylacja i ADP-rybozylacja. Istnieją także dowody świadczące o zachodzeniu metylacji histonu H1 (Jerzmanowski i Malaszewski, 1985).
a. Fosforylacja skorelowana z cyklem podziałowym komórki.
W H1 fosforylacji podlegają seryny i treoniny znajdujące się w obszarze N- i C-końca. Potranslacyjna fosforylacja końców białka histonu H1 związana jest ze wzrostem i z cyklem podziałowym komórki (Balhorn i inni 1972a,b; Roth i Allis, 1992). Stopień ufosforylowania histonów jest większy w komórkach dzielących się, niż w komórkach które zakończyły podziały i znajdują się w stanie spoczynku. Podczas cyklu komórkowego fosforylacja histonu rozpoczyna się w fazie G1 i powoli narasta w ciągu fazy S i G2. Maksymalny stopień ufosforylowania histonów łącznikowych osiągany jest w trakcie późnej fazy G2 i mitozy, po czym pod koniec mitozy następuje masowe usunięcie grup fosforanowych z cząsteczek histonu H1. W trakcie interfazy tylko część cząsteczek histonu H1 ulega fosforylacji (10-50%). W tym czasie na jedną cząsteczkę przypadają średnio 1-3 grupy fosforanowe. W czasie mitozy na jedną cząsteczkę H1 przypada 6-9 (w przypadku ssaków) (Gurley i inni, 1978), a nawet 25 grup fosforanowych (u niektórych niższych eukariontów) (Jerzmanowski i Malaszewski, 1985). W trakcie mitozy praktycznie 100% histonów łącznikowych ulega fosforylacji. Stwierdzono, że za fosforylację histonu H1 w mitozie odpowiedzialny jest kompleks składający się z kinazy p34cdc2 i cykliny B (Arion i inni, 1988; Draetta i Beach, 1988; Langan i inni, 1989). Kompleks ten (MPF-maturation promoting factor) jest kluczowym czynnikiem decydującym o odpowiednim przebiegu cyklu komórkowego. Histon H1 jest jednym z podstawowych substratów dla tego kompleksu. Nie wiadomo jaka jest funkcja masowej fosforylacji histonu H1 podczas mitozy. Istnieją dane świadczące o tym, iż aby nastąpiła fosforylacja mitotyczna, cząsteczki H1 muszą być przynajmniej częściowo uwolnione z chromatyny (Jerzmanowski i Cole, 1992). Mitotyczna fosforylacja H1 skorelowana jest w czasie z kondensacją chromatyny. Być może moment uwolnienia chromatyny od oddziaływań z histonem H1 pozwala na przyłączenie innych czynników białkowych decydujących o stopniu skondensowania chromatyny mitotycznej. Roli jaką odgrywa proces fosforylacji histonu H1 do tej pory nie wyjaśniono. Problem komplikuje fakt różnego stopnia ufosforylowania poszczególnych wariantów histonu H1. Dla 6 z 7 wariantów H1 u myszy przeprowadzono szczegółową analizę stopnia fosforylacji w trakcie cyklu komórkowego. Okazało się, że podczas fazy S warianty H1a, H1c i H10 pozostają w 70% nie zmodyfikowane lub mają przyłączoną tylko jedną grupę fosforanową, podczas gdy warianty H1b, H1d i H1e są ufosforylowane w dużo większym stopniu. Taka tendencja zachowywana jest także w trakcie fazy M cyklu podziałowego. Może to oznaczać, że stopień ufosforylowania poszczególnych wariantów H1 ma funkcjonalne znaczenie dla komórki eukariotycznej (Talasz i inni, 1996). Wykazano także nierównomierne rozmieszczenie w chromatynie niezmodyfikowanych i ufosforylowanych wariantów H1. Z badań przeprowadzonych nad chromatyną w makronukleusie u Tetrachymena wynika, że niezmodyfikowane cząsteczki H1 lokują się głównie w chromatynie nieaktywnej transkrypcyjnie, natomiast ufosforylowane histony łącznikowe znajdowane są w obszarach euchromatyny (Lu i inni, 1995).
b. ADP-rybozylacja histonu H1.
Proces ADP-rybozylacji zachodzi poprzez przeniesienie ADP-rybozy z NAD+ na cząsteczkę akceptorową, którą może stanowić białko. Następnie reszta ADP-rybozy (ADPR) związana z białkiem może przyłączać kolejne ADPR, tworząc w ten sposób poli ADP-rybozylowe łańcuchy związane z cząsteczką akceptora. Ten typ modyfikacji białek jest szeroko rozpowszechniony w przyrodzie. W 1966 Chambon roku wykazał jako pierwszy, że taka modyfikacja zachodzi w eukariotycznym jądrze komórkowym (Chambon, 1966). W kolejnych badaniach wykazano, że histony H1 podlegają tej modyfikacji (Nishizuka i inni, 1968). Analizy przeprowadzane zarówno in vitro jak i in vivo dowiodły, że łańcuchy składające się z kilkunastu reszt ADP-rybozylowych mogą być kowalencyjnie związane z N-końcem jednej cząsteczki histonu H1, oraz z C-końcem drugiej (sposób wiązania z C-końcem nie został ustalony) (Stone i inni, 1978; Nolan i inni, 1980; Wong, 1983a, 1984). Tego typu oddziaływania mogą powodować spinanie ze sobą odległych fragmentów chromatyny i sugerują, że ADP-rybozylowany H1 może odgrywać istotną role w stabilizacji wyższego rzędu struktur chromatyny (Butt i Smulson, 1980). Jednak istnieją także dane świadczące o tym, że ten rodzaj modyfikacji może być związany z dokładnie odwrotną sytuacją, to jest z relaksacją struktur chromatynowych (Wong i inni, 1983b; Malik i Smulson, 1984; Wong i Smulson 1984). Tak więc na razie nie można odpowiedzieć na pytanie, jaka jest fizjologiczna rola ADP-rybozylacji histonu H1. Przyjmuje się powszechnie, że ADP-rybozylacja histonu H1 związana jest z procesem naprawy DNA (Thi Man i Shall, 1982; Malik i inni, 1983). Ostatnio zaproponowano, że ADP-rybozylacja histonu H1 jest początkowym etapem apoptozy, ułatwiającym nukleazom komórkowym dostęp do międzynukleosomowego DNA (Yoon i inni, 1996).
Powyższe dane świadczą niezbicie o tym, że regulacja ekspresji genów odbywa się nie tylko na poziomie oddziaływań czynników transkrypcyjnych z sekwencjami regulatorowymi w DNA. Struktura chromatyny i białka biorące udział w jej modyfikowaniu pełnią często nadrzędną rolę w stosunku do czynników transkrypcyjnych. Wydaje się, że struktura chromatyny gra bardzo ważną rolę w regulacji ekspresji genów związanych z rozwojem. Lepsze poznanie mechanizmów decydujących o związku między budową chromatyny a regulacją transkrypcji przybliży nas być może do zrozumienia w jaki sposób z pojedynczej komórki powstaje dorosły organizm.