Budowa chromatyny i transkrypcja

Dr Radek Tomaszewski
radek@ibb.waw.pl
Pracownia Biologii Molekularnej Roślin




 

1. CHROMATYNA

W komórkach eukariotycznych DNA jądrowy występuje w postaci skondensowanej, tworząc kompleks nukleoproteinowy zwany chromatyną. Kondensacja DNA możliwa jest dzięki oddziaływaniom z białkami o charakterze zasadowym, głównie histonami. Chromatyna ma budowę regularną, a jej podstawową jednostkę strukturalną stanowi nukleosom, który obejmuje fragment DNA o długości około 200 par zasad, nawinięty na białkowy rdzeń zbudowany z histonów (Kornberg, 1974). Nukleosomowy typ budowy chromatyny oraz sama struktura nukleosomu są uniwersalne u wszystkich Eukaryota.

1.1 NUKLEOSOM - PODSTAWOWA JEDNOSTKA STRUKTURALNA CHROMATYNY

W skład nukleosomu wchodzi odcinek DNA o długości około 200 par zasad, tzw. cząstka rdzeniowa (ang. core particle) oraz cząsteczka histonu łącznikowego (ang. linker histone). Cząstkę rdzeniową tworzy regularny kompleks 8 histonów rdzeniowych (ang. core histones) (po 2 cząsteczki histonów H2A, H2B, H3 i H4) owiniętych fragmentem DNA o długości 146 par zasad, który tworzy niecałe 2 zwoje (Wolffe, 1994b). Sposób oddziaływania histonów rdzeniowych w oktamerze przypomina „uścisk dłoni” (ang. hand shake), a kluczową rolę w interakcjach między różnymi histonami rdzeniowymi przypisuje się charakterystycznym motywom strukturalnym w cząsteczkach histonów zwanym „zwinięciem” (ang. histone fold) (Arents i Moudrianakis, 1995).

Istnieją dwa modele opisujące położenie histonu łącznikowego w obrębie nukleosomu. Pierwszy zakłada, że jego domena globularna (zob. Wstęp, rozdział 1.2) wiąże się od zewnątrz i spina obie nici nukleosomowego DNA w miejscu ich wejścia i zejścia z powierzchni oktameru, dodatkowo oddziałując z mniejszą bruzdą DNA w rejonie osi symetrii nukleosomu (ang. dyad axis) (Wolffe, 1994b). Drugi model zakłada, że H1 wiąże się z dużą bruzdą DNA asymetrycznie w stosunku do osi nukleosomu i od wewnątrz DNA owiniętego wokół oktameru (Pruss i wsp., 1996). Histon łącznikowy jest spośród wszystkich histonów nasłabiej związany z DNA i oddysocjowuje w roztworach o sile jonowej przekraczającej 0.35 M NaCl (Stein, 1979).

Odkładanie nukleosomów w komórce jest sprzężone z replikacją DNA (Almouzni i Wolffe, 1993). Wiadomo, że u człowieka w wiązaniu acetylowanych histonów H3 i H4 do DNA bierze udział kompleks CAF-1 (ang. chromatin assembly factor), natomiast w dołączaniu H2A i H2B uczestniczy białko NAP-1 (ang. nucleosome assembly protein) (Krude i Elgin, 1996). Z kolei w oocytach Xenopus proces odkładania nukleosomów kontroluje nukleoplazmina (Laskey i wsp., 1978) oraz czynniki N1/N2 (Kleinschmidt i Franke, 1982) (zob. również: Wstęp, rozdział 3.1.1).

Chromatyna eukariotyczna daje się łatwo trawić nukleazą z Micrococcus (ang. Micrococcal nuclease, MNase), która przecina DNA między nukleosomami, tzw. DNA łącznikowe (ang. linker DNA). Proces trawienia jest wieloetapowy, a kolejne etapy prowadzą do uzyskania produktów odpowiadających poszczególnym poziomom organizacji nukleosomu. W pierwszej fazie trawienia powstaje produkt równy średniej odległości między nukleosomami (ang. nucleosomal spacing), który w zależności od organizmu i typu tkanki może wahać się od 160 do 220 par zasad (van Holde, 1989). W dalszym etapie trawienia degradacji ulega łącznikowy DNA, a produkt zostaje skrócony do odcinka o długości około 160 par zasad odpowiadającego tzw. chromatosomowi, który stanowi cząstkę rdzeniową wraz ze zasocjowanym z nią histonem H1 (Simpson, 1978). Dalsze trawienie nukleazą prowadzi do usunięcia H1 i otrzymania ściśle oddziałującego z oktamerem fragmentu DNA o długości 146 par zasad.

1.2 HISTONY

Wszystkie histony mają charakter zasadowy. Właściwość ta wynika z wysokiej zawartości lizyny i argininy. Histony rdzeniowe zbudowane są z domeny globularnej oraz z niezestrukturalizowanych fragmentów N- i C-końcowych, tzw. „ogonów”. Część globularna charakteryzuje się regularnym rozmieszczeniem ładunków elektrycznych i odpowiada za interakcje histonów między sobą oraz za wiązanie się z DNA. Funkcja „ogonów” nie jest do końca wyjaśniona, wiadomo jedynie, że w tym obszarze histony podlegają modyfikacjom kowalencyjnym (zob. dalej). Ładunki elektryczne w części globularnej histonów rdzeniowych rozmieszczone są równomiernie. Histony rdzeniowe są białkami o silnie konserwowanej sekwencji aminokwasowej, w szczególności dotyczy to części globularnej (Wolffe, 1994b).

W cząsteczce histonu łącznikowego (np. H1 lub H5) wyróżnia się 3 domeny: jedną globularną, odpowiedzialną za interakcje z DNA, oraz dwie zasadowe, niezestrukturalizowane domeny N- i C-końcową (Ramakrishnan i wsp., 1993). Histon H1 jest białkiem o największej zmienności wśród histonów, jednak i tu domena globularna wykazuje znaczną konserwatywność struktury (Wolffe, 1994b) Na różnorodność histonów łącznikowych największy wpływ ma obecność licznych wariantów sekwencyjnych tych białek oraz wymiana wariantów w trakcie rozwoju. Na przykład u Xenopus wyróżnia się wczesny wariant B4 akumulowany podczas oogenezy, następnie warianty somatyczne H1A, H1B i H1C syntetyzowane w fazie blastuli oraz wariant H10 występujący w tkankach terminalnie zróżnicowanych (Dimitrov i wsp., 1993). Dane literaturowe wskazują, że różnorodność podtypów histonów łącznikowych może pełnić istotną rolę regulacyjną w stosunku do transkrypcji genów (Hoyer-Fender i Grossbach, 1988; Storm i wsp., 1995).

Wszystkie histony mogą podlegać potranslacyjnym modyfikacjom w rejonie „ogonów”: acetylacji, fosforylacji, ubikwitynylacji, metylacji i ADP-rybozylacji (van Holde, 1989). Z punktu widzenia regulacji ekspresji genów najistotniejsze znaczenie odgrywa proces acetylacji histonów. Uważa się, że wysoki poziom acetylacji histonów H3 i H4 związany jest z rozluźnieniem struktury chromatyny i towarzyszy aktywacji transkrypcyjnej wielu genów (Turner, 1991; Lee i wsp., 1993) (por. Wstęp, rozdział 2.2.2). W ostatnim okresie udało się zidentyfikować kilka jądrowych acetylotransferaz, które okazały się znanymi od dawna czynnikami transkrypcyjnymi (Bannister i Kouzarides, 1996; Brownell i wsp., 1996; Mizzen i wsp., 1996; Spencer i wsp., 1997; Chen i wsp., 1997; Wang i wsp., 1997; Currie, 1998).

1.3 POZYCJONOWANIE NUKLEOSOMÓW

Położenie nukleosomu względem DNA określone jest przez dwa parametry: tzw. położenie translacyjne (ang. translational position), które opisuje granice oddziaływań DNA-histony i określa, która sekwencja znajduje się w DNA łącznikowym, oraz tzw. położenie rotacyjne (ang. rotational position) określające, która strona DNA oddziałuje z histonami, a która z otoczeniem (por. Wstęp, rozdział 2.2.2).

Z badań in vitro wynika, że łączenie się histonów z DNA zachodzi niezależnie od sekwencji. Prawdopodobnie większość nukleosomów w komórce nie jest przypisana do ściśle określonej sekwencji w DNA i wykazuje mobilność, której rezultatem może być ślizganie się nukleosomów wzdłuż nici DNA (ang. sliding). Część nukleosomów związana jest jednak ze specyficznymi fragmentami DNA (pozycjonowanie). Mobilność i pozycjonowanie nukleosomów są istotnymi elementami systemu regulacji ekspresji genów na poziomie transkrypcji, gdyż decydują o dostępności konkretnych sekwencji DNA dla czynników trans (por. Wstęp, rozdział 2.2.2) (Wolffe, 1994b).

Nie jest do końca jasne, jak zachodzi pozycjonowanie nukleosomów w chromatynie. Wśród mechanizmów, które mogą współdecydować o sposobie rozmieszczania nukleosomów, wymienia się replikację DNA, udział sekwencji specyficznie wiążących nukleosomy (zob. Wstęp, rozdział 3.1.2.3), oddziaływanie ze specyficznymi białkami pozycjonującymi oraz formowanie chromatynowych struktur wyższego rzędu (Thoma, 1992). Na pozycjonowanie nukleosomu mogą mieć także wpływ odcinki DNA wykazujące preferencje do wyginania się lub odcinki o strukturze usztywnionej (Simpson, 1991). Mobilność nukleosomów zmieniają również kompleksy białkowe stabilizujące lub rozluźniając strukturę chromatyny (zob. Wstęp, rozdział 2.2.3). Prawdopodobnie żaden z wymienionych czynników nie odgrywa roli decydującej, a końcowa pozycja zajmowana przez nukleosom w chromatynie jest efektem współdziałania wszystkich powyższych elementów.
 
 



 
 

2. TRANSKRYPCJA

2.1 APARAT TRANSKRYPCYJNY EUKARYOTA

2.1.1 Czynniki transkrypcyjne

W komórkach eukariotycznych istotą procesu aktywacji transkrypcji są interakcje promotora i sekwencji regulatorowych w DNA z czynnikami białkowymi, które oddziałują z polimerazami RNA (czynniki transkrypcyjne, ang. transcription factors) (por. rozdział 2.1.3). Wyróżnia się 3 kategorie tych czynników: 1) ogólne czynniki transkrypcyjne (ang. general factors) niezbędne do inicjacji syntezy RNA na wszystkich typach promotorów, 2) czynniki transkrypcyjne upstream (ang. upstream factors) rozpoznające krótkie specyficzne sekwencje cis położone przed miejscem startu (ang. upstream) syntezy RNA i zwiększające tempo inicjacji transkrypcji oraz 3) czynniki indukowalne (ang. inducible factors) analogiczne do czynników upstream, lecz syntetyzowane tylko w określonych tkankach i w określonym czasie, wiążące się specyficznie do sekwencji RE (ang. response elements). W rezultacie oddziaływań czynników trans z sekwencjami regulatorowymi możliwe staje się przyłączenie polimerazy RNA i utworzenie kompleksu transkrypcyjnego (zob. rozdział 2.1.3). Czynniki transkrypcyjne odgrywają kluczową rolę w procesie inicjacji transkrypcji, nie są natomiast niezbędne do elongacji łańcucha RNA (Lewin, 1997).

2.1.2 Polimerazy RNA

U Eukaryota istnieją trzy typy polimeraz RNA. Podstawą ich klasyfikacji jest przede wszystkim wrażliwość na cykliczny oktapeptyd, a -amanitynę. Hamuje on już przy niskich stężeniach aktywność polimerazy RNA II, natomiast nie wywiera wpływu na polimerazę RNA I. Efekt a -amanityny na polimerazę RNA III zależy od organizmu; wiadomo, że enzym jest hamowany przy wysokich stężeniach inhibitora w komórkach zwierzęcych (Lewin, 1997). Polimerazy RNA typu I zlokalizowane są w jąderku i odpowiadają za syntezę rybosomalnego RNA. Obszary chromatyny transkrybowane przez tę klasę polimeraz to przede wszystkim sekwencje kodujące 18S i 28S rRNA. Polimerazy RNA II i III znajdują się w nukleoplaźmie (poza jąderkiem). Polimerazy klasy II prowadzą syntezę heterogennego jądrowego RNA (hnRNA), będącego prekursorem mRNA, natomiast polimerazy RNA III syntetyzują tRNA i inne małe RNA (m. in. 5S RNA, niektóre snRNA). Względne aktywności polimeraz klasy I, II i III stanowią odpowiednio 60, 30 i 10 % całkowitej aktywności polimeraz RNA w komórce (Lewin, 1997).
 
 

2.1.3 Inicjacja transkrypcji

Żadna z eukariotycznych polimeraz nie jest w stanie rozpoznawać promotora samodzielnie. Rolę tę pełnią czynniki transkrypcyjne, które oprócz tego wiążą polimerazę i umiejscawiają ją precyzyjnie na promotorze. Samo powstanie kompleksu inicjacyjnego jest procesem wieloetapowym, w którym uczestniczy szereg białek (Lewin, 1997).

Transkrypcja genów dla polimerazy RNA I znajduje się pod kontrolą dwuczęściowych sekwencji położonych przed miejscem startu transkrypcji. Sam rdzeń promotora obejmuje pozycje od -45 do +20, a dodatkowa sekwencja UCE (ang. upstream control element) zlokalizowana w pozycji od -180 do -107 jest bogata w pary GC. Inicjacja transkrypcji przez polimerazę RNA I wymaga związania 2 czynników: UBF1 (ang. upstream binding factor), specyficznie rozpoznającego sekwencję rdzenia promotora i UCE, oraz czynnika SL1 wiążącego się kooperatywnie po przyłączeniu UBF1 (Lewin, 1997).

Polimeraza RNA III wykorzystuje 3 typy promotorów. Promotory typu 1 i 2 znajdują się za miejscem startu transkrypcji (ang. downstream). Obejmują one wewnątrzgenowe sekwencje DNA (ang. internal control regions, ICR) złożone albo z domen A i C przedzielonych sekwencją IE (ang. intermediate element) (np. promotory genów 5S rRNA), albo z domen A i B (np. promotory genów tRNA) (Geiduschek i Tocchini-Valentini, 1988). W typie 3 znaleziono tzw. bliski i daleki promotor (ang. proximal i distal sequence element, PSE i DSE) położone przed miejscem startu transkrypcji (np. geny U6 snRNA). W transkrypcji genów klasy III biorą udział tylko trzy ogólne czynniki transkrypcyjne: TFIIIA, TFIIIB i TFIIIC, które wiążą się w obszarze promotora przed przyłączeniem polimerazy, tworząc kompleks pre-inicjacyjny (ang. pre-initiation complex).

Promotory genów dla polimerazy RNA II składają się z rdzenia oraz dodatkowych sekwencji regulatorowych (ang. cis-acting elements). Rdzeń promotora obejmuje blok TATA w pozycji od -30 do -25 i zwykle krótką sekwencję bogatą w pirymidyny w pobliżu miejsca startu transkrypcji. Elementy cis znajdują się powyżej miejsca startu syntezy RNA i przed blokiem TATA. Należą do nich m. in. sekwencja CAAT (ang. CAAT box) w pozycji -75 oraz sekwencje GC (ang. GC box) w pozycjach od -40 do -70 (Roeder, 1996). Sekwencje regulatorowe cis w obrębie promotorów genów klasy II rozpoznawane są przez specyficzne czynniki białkowe trans (ang. trans-acting factors). Do sekwencji regulatorowych genów klasy II zalicza się również tzw. wzmacniacze (ang. enhancers), które same nie są w stanie kontrolować aktywności polimerazy RNA, lecz mogą oddziaływać przez aktywatory, których przyłączenie prowadzi do zgięcia DNA i zbliżenia sekwencji wzmacniacza do promotora. Z tego względu enhancery mogą wywierać efekt nawet na duże odległości i niezależnie od orientacji samej sekwencji. Odrębna klasa sekwencji regulatorowych nazywana jest elementami RE (ang. response elements) (por. rozdział 2.1.1), wiążą się do nich indukowalne czynniki trans. Na obecności elementów RE i czynników indukowalnych opiera się istota regulacji ekspresji genów na poziomie transkrypcji u Eukaryota (Lewin, 1997).

Sekwencja TATA stanowi miejsce specyficznego wiązania czynnika transkrypcyjnego TFIID, który jako pierwszy lokuje się na promotorze (Burley, 1996). TFIID składa się z 2 elementów: białka rozpoznającego i wiążącego sekwencję TATA (ang. TATA-binding protein, TBP) oraz podjednostek związanych z TBP (ang. TBP-associated factors, TAFs) (Buratowski i wsp., 1989). Przyłączenie czynnika TFIID wywołuje odkształcenie nici DNA i w rezultacie zbliżenie sekwencji położonych przed i za blokiem TATA. Umożliwia ono związanie czynnika TFIIA, który może stabilizować oddziaływania TBP z DNA w tzw. słabych promotorach (Tan i wsp., 1996). Następnie dochodzi do związania TFIIB i przyłączenia kompleksu polimeraza RNA II-TFIIF (Leuther i Bushnell, 1996), w wyniku czego powstaje kompleks pre-inicjacyjny. Przekształcenie w aktywny kompleks transkrypcyjny zachodzi wskutek fosforylacji domeny CTD polimerazy (ang. carboxy-terminal domain) przy udziale czynników TFIIE i TFIIH (Buratowski, 1994; Roeder, 1996). TFIIH obok aktywności kinazy białkowej ma aktywność helikazy rozluźniającej DNA na odcinku 10 par zasad przed miejscem startu transkrypcji (Svejstrup, 1996). Rozluźnienie nici DNA jest następnie przemieszczane zgodnie z kierunkiem syntezy RNA (Holstege i wsp., 1996). Rozpoczęciu transkrypcji przez polimerazę towarzyszy odłączenie czynników transkrypcyjnych od kompleksu.

2.1.4 Interakcje czynników trans z DNA

W strukturze czynników transkrypcyjnych zidentyfikowano kilka typowych domen odpowiedzialnych za wiązanie do DNA oraz interakcje z innymi białkami. Do najpowszechniejszych motywów należą: palce cynkowe (ang. zinc finger), heliks-skręt-heliks (ang. helix-turn-helix), heliks-pętla-heliks (ang. helix-loop-helix, HLH) i suwak leucynowy (ang. leucine zipper) (Lewin, 1997).

Aktywność indukowanych czynników transkrypcyjnych podlega złożonemu systemowi regulacji i może być kontrolowana na wiele sposobów: przez syntezę (np. czynniki tkankowo-specyficzne), przez fosforylację (np. czynnik HSTF, ang. heat shock transcription factor) (Pahlvani i wsp., 1995) lub defosforylację (np. podjednostka Jun w heterodimerze AP1, ang. activator protein) (Edwards i wsp., 1992), przez wiązanie ligandu (np. receptory steroidowe), przez odłączenie od inhibitora (np. czynnik NFk B) (Chytil i Verdine, 1996) i przez zmianę struktury drugiej podjednostki w obrębie dimeru (np. białka HLH).
 
 

2.2 TRANSKRYPCJA A STRUKTURA CHROMATYNY

W komórkach Eukaryota ze względu na upakowanie DNA w struktury nukleoproteinowe transkrypcja zachodzi na matrycy chromatynowej. Jest faktem bezspornym, że struktura chromatyny odgrywa kluczową rolę w regulacji ekspresji genów. Wiadomo, że chromatyna podlega transkrypcji w niejednakowym stopniu, a niektóre geny (tzw. geny milczące, ang. silent genes) pozostają nieaktywne mimo obecności w komórce białek potrzebnych do ich transkrypcji. Obszary jądra zawierające geny o wysokiej aktywności transkypcyjnej (tzw. euchromatyna) różnią się pod względem strukturalnym od tzw. heterochromatyny, w której transkrypcja jest wyłączona. W obu typach chromatyny istnieją nukleosomy, jednak obszary aktywne transkrypcyjnie są bardziej podatne na nukleazy, co by sugerowało, że ich struktura jest bardziej rozluźniona. Wiadomo również, że aktywacji genu towarzyszy reorganizacja struktury chromatyny (Wolffe, 1994; Lewin, 1997).

Proces transkrypcji sprowadzony jedynie do poziomu oddziaływań między DNA, czynnikami transkrypcyjnymi i polimerazami RNA jest uproszczeniem, które można zastosować wyłącznie na użytek układu in vitro. Przy opisie zdarzeń zachodzących w komórce musi zostać uwzględniona obecność struktur nukleosomowych oraz indukowanych przez H1 struktur wyższego rzędu w postaci tzw. włókien 30 nm, które stanowią poważną przeszkodę w rozpoznawaniu sekwencji regulatorowych przez czynniki transkrypcyjne. Z tego powodu u Eukaryota istnieją mechanizmy umożliwiające zmianę struktury chromatyny w chwili aktywacji genu, a tym samym ułatwiające czynnikom trans dostęp i oddziaływanie z sekwencjami w DNA. Przez wiele lat jedynymi kandydatami do roli regulatorów transkrypcji były histony tworzące rdzeń nukleosomu oraz histon H1. Choć nikt dziś nie kwestionuje udziału histonów w regulacji ekspresji genów u Eukaryota (Grunstein, 1990; Felsenfeld, 1992; Kamakaka i wsp., 1993; Adams i Workman, 1993) (por. Wstęp, rozdziały 2.2.2 i 2.2.3), to jednak coraz większą wagę przywiązuje się do takiego modelu regulacji ekspresji genów, w którym kluczową rolę odgrywają oprócz interakcji DNA z histonami również interakcje z białkami wchodzącymi w skład kompleksów oddziałujących bezpośrednio na elementy strukturalne chromosomu. Takie kompleksy regulatorowe zmieniają strukturę chromatyny w dwojaki sposób: albo zwiększają dostępność DNA dla czynników transkrypcyjnych i ułatwiają zorganizowanie aktywnego kompleksu transkrypcyjnego (aktywatory transkrypcji) (Winston i Carlson, 1992), albo stabilizują histony na powierzchni DNA i utrudniają kontakt czynników transkrypcyjnych z sekwencjami regulatorowymi genu (repesory transkrypcji) (por. Wstęp, rozdział 2.2.4). Efektem rozluźnienia struktury chromatyny jest zawsze aktywacja transkrypcji, natomiast stabilizacja struktur chromatynowych przez kompleksy białkowe prowadzi do represji transkrypcji (Kingston i wsp., 1996). W badaniach eksperymantalnych efekt rozluźnienia chromatyny można obserwować w postaci jej zwiększonej wrażliwości na DNazę I (ang. DNase I hypersensitivity) (Felsenfeld, 1978). Właściwość ta jest silnie skorelowana z aktywnością transkrypcyjną genów i nie występuje w wyciszonych obszarach chromatyny (Lewin, 1997).

2.2.1 Modele aktywacji genów u Eukaryota

Kluczowym pytaniem, jakie towarzyszy badaniom nad mechanizmami regulacji transkrypcji u Eukaryota, jest pytanie o to, w jaki sposób czynniki transkrypcyjne uzyskują dostęp do promotora w chromatynie. W oparciu o dotychczasowe dane eksperymentalne zaproponowano dwa modele wyjaśniające mechanizm zmian struktury chromatyny w aktywowanych genach: model konkurencji (ang. pre-emptive model) i model dynamiczny (ang. dynamic model).

2.2.1.1 Model konkurencji

Model ten zakłada istnienie współzawodnictwa między dwoma procesami: tworzenia kompleksu transkrypcyjnego i rekonstytucją nukleosomów w obrębie promotora. Mechanizm miałby polegać na konkurowaniu histonów i czynników trans w wiązaniu się do DNA. W rezultacie, jeżeli na promotorze najpierw uformują się nukleosomy, to nie będą mogły związać się już czynniki transkrypcyjne. I odwrotnie, związanie czynników transkrypcyjnych oraz utworzenie kompleksu inicjacyjnego wyklucza możliwość powstania nukleosomu (Lewin, 1997) (Ryc. 1A).

Potwierdzeniem modelu konkurencji są wyniki wczesnych badań in vitro, w których wykazano, że czynnik TFIIIA nie jest w stanie aktywować genów 5S rRNA, gdy są one skompleksowane z histonami, natomiast histony dodane do mieszaniny z uformowanym już kompleksem transkrypcyjnym nie przeciwdziałają istniejącej aktywacji genu (Almouzni i wsp., 1990a). Z kolei aktywacja lub represja transkrypcji genów dla polimerazy RNA II zależy od tego, czy najpierw do mieszaniny dodano czynnik TFIID, czy histony (Workman i Roeder, 1987).

Zgodnie z założeniami modelu współzawodnictwa atywacja genów polega więc na przyłączaniu się czynników transkrypcyjnych do nagiego DNA, który występuje w komórce zaraz po zakończeniu replikacji a jeszcze przed odtworzeniem chromatyny (Svaren i Chalkey, 1990; Felsenfeld, 1992; Adams i Workman, 1993) (zob. także: Wstęp, rozdział 2.2.2).

2.2.1.2 Model dynamiczny

Model ten opiera się na założeniu, że aktywacji genu towarzyszy dysrupcja struktury chromatyny. Proces ten jest energetycznie kosztowny i musi być sprzężony z hydrolizą ATP (Lewin, 1997) (Ryc. 1B). Efektem dysrupcji chromatyny jest rozluźnienie jej struktury i umożliwienie inicjacji transkrypcji. In vitro system taki udało się skonstruować dla promotora hsp70 genów szoku cieplnego u Drosophila. Wiązanie specyficznego czynnika transkrypcyjnego GAGA do promotora przeorganizowuje strukturę chromatyny w taki sposób, że nukleosomy zajmujące dotychczas

przypadkowe pozycje są pozycjonowane, a w rejonie promotora pojawia się nadwrażliwość na DNazę I. Cały proces wymaga hydrolizy ATP, a czynnik GAGA może wywierać efekt nawet wtedy, gdy został dodany do mieszaniny po rekonstrukcji nukleosomów (Taylor i wsp., 1991; Tsukiyama i wsp., 1994) (zob. również: rozdział 2.2.3.1). Inne systemy dysrupcji nukleosomów na promotorach genów eukariotycznych opisano w rozdziale 2.2.2.
 
 

2.2.2 Nukleosomy i transkrypcja

Obecność nukleosomów stanowi fizyczną przeszkodę w procesie inicjacji transkrypcji (Morse, 1986; Lorch i wsp., 1987; Svaren i Chalkey, 1990; Grunstein, 1990). Wynika to z kilku przesłanek: po pierwsze, jedna strona podwójnej helisy DNA jest zawsze skierowana do powierzchni nukleosomu i nie może oddziaływać z czynnikami transkrypcyjnymi. Po drugie, wygięcie DNA spowodowane kontaktem z histonami rdzeniowymi wymaga dopasowania przestrzennego czynników transkrypcyjnych do krzywizny nukleosomowego DNA. Po trzecie, naładowane dodatnio N-końcowe „ogony” histonów rdzeniowych położone w obrębie dużej bruzdy DNA ograniczają kontakt czynników transkrypcyjnych z DNA (Wolffe, 1994b).

Z analizy szczepów drożdży, w których nie zachodzi synteza histonów, wynika, że utracie nukleosomów towarzyszy uruchomienie transkrypcji wielu nieczynnych wcześniej genów (Han i Grunstein, 1988). Z kolei z badań in vitro wiadomo, że rdzenie nukleosomów silnie hamują zarówno inicjację (Lorch i wsp., 1987) jak i elongację (O’Neill i wsp., 1992) transkrypcji przez polimerazę RNA z faga T7, a hamujący wpływ nukleosomów na transkrypcję przez eukariotyczną polimerazę RNA II wykazali Laybourn i Kadonaga (Laybourn i Kadonaga, 1991). Powyższe dane wskazują, że stabilna struktura nukleosomowa zmniejsza intensywność transkrypcji. Aby proces mógł zachodzić wydajnie, musi nastąpić rozluźnienie struktury chromatyny udostępniające czynnikom trans sekwencje regulatorowe w DNA mimo obecności nukleosomów. Do najistotniejszych mechanizmów reorganizacji struktury chromatyny zaliczyć można pozycjonowanie nukleosomu, usunięcie nukleosomu z obszaru promotora oraz modyfikacje histonów przez acetylację (Wolffe, 1994a; Wolffe, 1994b).

Pozycjonowanie nukleosomu

W nukleosomie granice oddziaływań DNA-histony określone są przez tzw. położenie translacyjne, natomiast orientację danej sekwencji DNA względem histonów opisuje tzw. położenie rotacyjne (por. Wstęp, rozdział 1.3). Sekwencje, które mają zostać rozpoznane przez czynniki transkrypcyjne, muszą być zorientowane na zewnątrz nukleosomu albo zlokalizowane w obrębie DNA łącznikowego. Spozycjonowany nukleosom ułatwia więc transkrypcję wtedy, gdy eksponuje sekwencje regulatorowe w sposób ułatwiający ich kontakt z czynnikami transkrypcyjnymi oraz gdy dzięki upakowaniu DNA umożliwia zbliżenie sekwencji regulatorowych oddalonych od siebie o wielokrotność długości pojedynczego skrętu DNA w nukleosomie (Wolffe, 1994b). Z kolei represja transkrypcji wskutek pozycjonowania ma miejsce wtedy, gdy sekwencje regulatorowe zamknięte są w obrębie nukleosomu i stają się niedostępne dla elementów trans (Lu i wsp., 1994).

Przykładem aktywacji transkrypcji przez spozycjonowany nukleosom jest promotor vitellogeniny B1 Xenopus. Związanie nukleosomu pomiędzy enhancerem a miejscem wiązania czynnika HNF3 (ang. hepatocyte nuclear factor) i czynnika NF1 (ang. nuclear factor) prowadzi do powstania pętli DNA, w której elementy promotora i enhancera zbliżają się do siebie, stymulując transkrypcję (Schild i wsp., 1993).

Usunięcie nukleosomu z obszaru promotora

Nukleosom może zostać usunięty w sposób indukowany (ang. induced displacement) lub na stałe (ang. permanent displacement) (Adams i Workman, 1993; Workman i Buchman, 1993).

Dobrze opisanym przykładem regulacji transkrypcji przez indukowane usunięcie nukleosomu jest gen mysiego wirusa raka sutka (ang. mouse mammary tumor virus, MMTV). Promotor genu MMTV obejmuje 5 spozycjonowanych nukleosomów (Richard-Foy i Hager, 1987). Aktywacja transkrypcji tego genu wymaga związania się receptora glukokortykoidowego z DNA, w wyniku czego dochodzi do dysrupcji 2 nukleosomów przylegających do bloku TATA i do uformowania kompleksu pre-inicjacyjnego (Cordingley i wsp., 1987; Zaret i Yamamoto, 1984). Mechanizm dysrupcji nukleosomów polega tu na usunięciu histonu H1 z obszaru DNA łącznikowego (Bresnick i wsp., 1992) i interakcji z czynnikiem jądrowym NF-1, który konkuruje z H1 o miejsce wiązania do linkera (Lee i Archer, 1994; Archer i wsp., 1992). W rezultacie powstaje aktywny kompleks transkrypcyjny, który jest jednak nietrwały. Po odłączeniu się kompleksu promotor MMTV zostaje ponownie zablokowany przez nukleosom (Lee i Archer, 1994).

Podobnie przebiega aktywacja genu PHO5 kodującego kwaśną fosfatazę u drożdży. Spadek stężenia nieorganicznego fosforanu wywołuje reorganizację struktury promotora, podczas której cztery z sześciu nukleosomów zlokalizowanych na promotorze zostają usunięte (Almer i Hö rz, 1986; Almer i wsp., 1986). Do odblokowanego obszaru promotorowego przyłącza się kompleks transkrypcyjny (Fascher i wsp., 1990).

Analiza pozycjonowania nukleosomów na drożdżowym genie URA3 transkrybowanym pod kontrolą indukowanego promotora pokazała, że aktywacji genu towarzyszy zniesienie pozycjonowania nukleosomów przy jednoczesnym zachowaniu ich dotychczasowej gęstości na promotorze i genie. Stan represji prowadzi natomiast w krótkim czasie do unieruchomienia nukleosomów (Cavalli i Thoma, 1993).

Stałe usunięcie nukleosomów z rejonu promotora zachodzi w przypadku genów transkrybowanych konstytutywnie i ma miejsce bezpośrednio po replikacji DNA (Almouzni i wsp., 1990a). Przykładem systemu, w którym nukleosomy usuwane są na stałe, jest promotor hsp26 genów szoku cieplnego u Drosophila. Dochodzi na nim do zależnej od ATP dysrupcji nukleosomów w wyniku wiązania specyficznego czynnika GAGA (Taylor i wsp., 1991; Tsukiyama i wsp., 1994) (por. Wstęp, rozdział 2.2.1.2).

Acetylacja histonów

Alternatywą do usuwania nukleosomu z obszaru promotora jest acetylacja histonów tworzących nukleosom. Acetylacja od dawna uznawana jest za proces związany z transkrypcją. Jej efektem jest obniżenie dodatnich ładunków na N-końcach białek i osłabienie oddziaływań między „ogonami” histonów a nukleosomowym DNA (Cary i wsp., 1982). W rezultacie zachodzą zmiany konformacyjne nukleosomu umożliwiające łatwiejsze dojście czynników transkrypcyjnych do sekwencji regulatorowych w DNA (Turner, 1991). Z badań in vitro wynika, że acetylacji „ogonów” histonowych w obrębie nukleosomu spozycjonowanego na genie 5S rRNA towarzyszy przyłączenie czynnika TFIIIA (Lee i wsp., 1993) oraz że sztuczne usunięcie „ogonów” histonowych z obszaru dużej bruzdy DNA ułatwia dostęp czynników trans do DNA w nukleosomie (Vettesse-Dadey i wsp., 1994).

Nukleosomy stanowią istotną przeszkodę również w procesie elongacji RNA (Morse, 1986). Do niedawna istniało kilka hipotez próbujących pogodzić elongację transkrypcji z obecnością oktamerów histonowych. Najbardziej prawdopodobny model zakładał destabilizację rdzenia nukleosomu pod wpływem przesuwającej się polimerazy i przemieszczenie tetrameru H3-H4 na wolną nić DNA za polimerazą poprzedzone oddysocjowaniem dimeru H2A-H2B, następnie ponowne przyłączenie dimeru H2A-H2B i odtworzenie struktury nukleosomu (ang. progressive displacement) (van Holde i wsp., 1992; Adams i Workman, 1993). Aktualnie dominuje jednak pogląd, że oktamer histonowy przemieszcza się, nie oddysocjowując od DNA (Clark i Felsenfeld, 1992; Studitsky i wsp., 1994). Cały proces miałby polegać na odwinięciu DNA z oktameru przed polimerazą i ponownym jego nawinięciu na oktamer po przejściu enzymu (tzw. obejście transkrybującej polimerazy przez nukleosom). Wyniki badań z polimerazą RNA z faga SP6 wskazują na możliwość tworzenia przez polimerazę pozytywnych superskrętów na nici DNA z przodu kompleksu enzymatycznego. Dodatnie superskręty sprzyjają usuwaniu oktamerów sprzed polimerazy i przenoszeniu ich do tyłu na fragment nici negatywnie superskręcony, jednak bez utraty kontaku z DNA i/lub polimerazą (Studitsky i wsp., 1995; Felsenfeld i wsp., 1996).

W doświadczeniach in vitro pokazano, że polimeraza RNA II wydłuża transkrypty z wysoką wydajnością tylko na nagich matrycach DNA, natomiast zorganizowanie DNA w strukturę nukleosomową znacznie spowalnia proces elongacji (Izban i Luse, 1992). Rdzenie nukleosomów hamują również elongację transkrypcji przez polimerazę RNA z faga T7, a obserwowany 3-4-krotny spadek liczby transkryptów zachodzi prawdopodobnie na skutek zablokowania promotora T7 przez rdzenie nukleosomów (O’Neill i wsp., 1992).

2.2.3 Kompleksy białkowe zmieniające strukturę chromatyny

Charakterystyka kompleksów białkowych zmieniających strukturę chromatyny jest niezbędna do zrozumienia ogólnych mechanizmów transkrypcji, a szczególnie procesów rozwoju. Wiele bowiem z omawianych tu białek odkrytych zostało przy okazji badania mutacji rozwojowych związanych m. in. z segmentacją u Drosophila, przełączaniem typów koniugacyjnych u drożdży i neoplazją u ssaków (Stern i wsp., 1984; Kennison i Tamkun, 1988; Haupt i wsp., 1991; van Lohuizen i wsp., 1991). Na początku lat 90-tych przypuszczano, że białka aktywujące lub hamujące transkrypcję są bezpośrednio zaangażowane w modyfikację struktury chromatyny. Dowodów na to dostarczyło m.in. odkrycie mutacji w rejonie N-końca histonu H4 hamującej aktywację promotorów PHO5 i GAL1 u drożdży. W rezultacie zaproponowano mechanizm, w którym czynniki te miałyby oddziaływać wprost z N-końcem histonu (Durrin i wsp., 1991). Od tej pory udało się zidentyfikować wiele czynników, których funkcja polega na destabilizacji struktury chromatyny (aktywatory) lub stabilizacji nukleosomów (represory), prowadzących odpowiednio do aktywacji lub represji transkrypcji. Z czasem okazało się, że wiele z tych białek wymaga obecności dodatkowych czynników pełniących rolę koaktywatorów w reorganizacji struktury chromatyny (Lorch i wsp., 1992). Do najlepiej poznanych kompleksów należą SWI/SNF z drożdży oraz NURF i Polycomb z Drosophila.

2.2.3.1 Aktywatory transkrypcji

Kompleks SWI/SNF z S. cerevisiae

Geny grupy SWI są konieczne do regulacji zmian typu koniugacyjnego u drożdży (Stern i wsp., 1984; Breeden i Nasmyth, 1987), część z nich jest niezbędna do prawidłowej transkrypcji niektórych genów drożdżowych (Peterson i Herskowitz, 1992). Z kolei geny z grupy SNF okazały się potrzebne m. in. do transkrypcji SUC2 (Neigeborn i Carlson, 1984). Dalsze badania pokazały, że produkty genów SWI/SNF tworzą kompleks białkowy, który destabilizuje strukturę chromatyny. Zidentyfikowano mutacje w genach SIN zdolne do częściowej supresji mutacji w genach SWI (Sternberg i wsp., 1987; Kruger i wsp., 1995). Mutacje te lokowały się w histonach H3 i H4 w rejonach odpowiedzialnych m. in. za wiązanie histonów do DNA i znosiły efekt braku kompleksu SWI/SNF (Kruger i wsp., 1995). Również obniżenie poziomu histonów H2A i H2B suprymuje fenotyp swi/snf (Hirschhorn i wsp., 1992). Powyższe dane sugerują, że kompleks SWI/SNF oddziałuje z białkami chromatyny destabilizując jej strukturę i ułatwiając dostęp czynników transkrypcyjnych do DNA. Stwierdzono, że kompleks aktywatorowy SWI/SNF jest ATP-azą zależną od DNA (Laurent i wsp., 1993; Cô té i wsp., 1994), zaś destabilizacja chromatyny polega prawdopodobnie na indukowaniu przez SWI/SNF pozytywnych superskrętów na nici DNA (Quinn i wsp., 1996). Znanych jest szereg genów homologicznych do drożdżowych SWI/SNF, m. in. ludzkie geny Brg1 i hBrm (Khavari i wsp., 1993; Muchardt i Yaniv, 1993) oraz geny Brahma z Drosophila (Kennison i Tamkun, 1988; Tamkun i wsp., 1992). Produkty tych genów wykazują aktywność ATP-azową i powodują dysrupcję chromatyny (Imbalzano i wsp., 1994; Kwon i wsp., 1994).

Kompleks NURF z Drosophila

Czynnik NURF (ang. nucleosome remodeling factor) jest zależnym od ATP kompleksem białkowym współdziałającym in vitro z czynnikiem GAGA w reorganizacji struktury chromatyny (Tsukijama i Wu, 1995). W indukowane przez NURF zmiany struktury nukleosomowej zaangażowane są prawdopodobnie N-końce histonów rdzeniowych (Georgel i wsp., 1997). Gen ISWI (ang. imitation switch) koduje jedną z podjednostek kompleksu i jest podobny w części kodującej domenę ATP-azową do genu SNF2/SWI2 z drożdży (Elfring i wsp., 1994), wykazuje także wysoką homologię do genu hSNF2 człowieka (Okabe i wsp., 1992) i genu YB95 drożdży (Tsukijama i wsp., 1995).

Specyficzne aktywatory transkrypcji

Ta klasa aktywatorów stanowi grupę białek działających pojedynczo (nie w kompleksach) i wyłącznie na matrycę chromatynową. Należą tu m. in. czynnik GAGA u Drosophila i białko LEF-1 u ssaków. Czynnik GAGA bierze udział w zależnym od ATP ustalaniu struktury nukleosomowej na promotorach genów hsp 26 i hsp70 (Lis i Wu, 1993; Wall i wsp., 1995), przeorganizowuje strukturę chromatyny w kooperacji z kompleksem NURF (Tsukijama i wsp., 1994) i znosi represyjny efekt histonu H1 (Crosten i wsp., 1991) (por. Wstęp, rozdziały 2.2.1.2 i 2.2.4.1). Białko LEF-1 bierze udział w ustalaniu właściwej struktury przestrzennej enhancerów poprzez wyginanie nici DNA (Geise i wsp., 1992).
 
 

2.2.3.2 Represory transkrypcji

Białka SIR u S. cerevisiae

Białka SIR (ang. silent information regulator) obok histonów H3 i H4 biorą udział w wyciszaniu transkrypcji genów w obszarach SML (ang. silent mating loci) oraz w okolicach telomerów u drożdży. Obszary te wykazują wiele cech heterochromatyny. Białko SIR oddziałuje bezpośrednio z N-końcami histonów H3 i H4 (Hecht i wsp., 1995; Roth, 1995), kompleksem ORC (ang. origin recognition complex) (Newlon, 1993; Palladino i Gasser, 1994) oraz czynnikiem RAP1. Białko RAP1 identyfikuje sekwencje DNA, które mają zostać wyciszone i specyficznie się z nim wiąże. Związanie czynnika RAP1 umożliwia interakcję białek SIR z histonami H3 i H4, a powstały kompleks represorowy rozprzestrzenia się w chromatynie, indukując zmiany jej struktury (Moretti i wsp., 1994). W regulację represji związanej z telomerami zaangażowanych jest prawdopodobnie więcej czynników, a sam jej mechanizm nie jest do końca poznany. Wydaje się jednak pewne, że struktura chromatyny ma kluczowe znaczenie w wyciszaniu transkrypcji genów (Kingston i wsp., 1996).

Białka SSN6/TUP1 u S. cerevisiae

Czynniki SSN6 i TUP1 u drożdży decydują o represji genów, które były aktywne w określonych warunkach wzrostu, m. in. genów SUC2 i GAL1/GAL10 (Johnson, 1995; Roth, 1995). Mechanizm represji polega na porządkowaniu struktury nukleosomowej w kontrolowanym obszarze genu pod wpływem białek SSN6 i TUP1, które jednak same nie łączą się z DNA, a jedynie oddziałują na inne białka związane z DNA, na przykład a 2/MCM1 (Johnson, 1995). Represja może zostać zniesiona w odpowiednich warunkach wzrostu. Po zniesieniu stanu represji ułożenie nukleosomów ulega całkowitej zmianie (Roth i wsp., 1990; Shimizu i wsp., 1991; Axelrod i wsp., 1993; Cavalli i Thoma, 1993; Cooper i wsp., 1994; Hirschhorn i wsp., 1995). Prawdopodobnie mechanizm represji wywołanej przez białko TUP1 polega na oddziaływaniu z „ogonami” histonów H3 i H4, gdyż mutacje w N-końcowej części tych histonów znoszą narzucony przez TUP1 stan represji genów (Edmondson i wsp., 1996).

Kompleks Polycomb z Drosophila

Geny grupy Pc-G (ang. Polycomb-group) są represorami genów homeotycznych i zostały znalezione przy okazji badania mutacji w tych genach (Simon, 1995). Białka Pc zawierają konserwowany ewolucyjnie motyw „chromodomeny” zidentyfikowany w specyficznie związanym z heterochromatyną białku HP1 (Paro i Hogness, 1991). Samo białko Pc nie ma zdolności wiązania się z DNA i przypuszczalnie działa w kooperacji z innymi czynnikami (Kingston i wsp., 1996). Funkcją produktów genów Pc-G jest ustalanie represyjnego stanu chromatyny w obszarze genów homeotycznych. Dowodów na to dostarczyły prace, w których badano efekt termowrażliwej mutacji w jednym z genów grupy Pc-G, genie E(z) (ang. enhancer of zeste). Zaobserwowano rozluźnienie struktury nukleosomów politenicznych i rozpad kompleksu Pc-G skorelowane z termiczną inaktywacją produktu genu E(z) (Rastelli i wsp., 1993). Utworzona przy udziale białek Pc-G represyjna struktura chromatyny utrzymywana jest przez wiele podziałów komórkowych prawdopodobnie wskutek dziedziczenia epigenetycznego (Kingston i wsp., 1996). Mechanizm tworzenia się takiej struktury jest jednak jak dotąd nieznany, a system in vitro, w którym można by wykazać związek między formowaniem się nukleosomów a obecnością białek Pc-G, nie istnieje (Kingston i wsp., 1996).
 
 

2.2.4 Histon H1

W cząsteczce histonu H1 nie ma typowej dla histonów rdzeniowych i uznawanej za najstarszą ewolucyjnie domeny „zwinięcia” (ang. histone fold) (Arents i Moudrianakis, 1995). Również samo położenie H1 w stosunku do DNA w chromosomie jest odmienne od pozostałych histonów (zob. Wstęp, rozdział 1.1). Nie można wykluczyć możliwości, że H1 był w przeszłości czynnikiem transkrypcyjnym, który z czasem zaczął pełnić dodatkową rolę elementu strukturalnego w chromatynie. Istotne są tu dane wskazujące na duże podobieństwo struktury domeny wiążącej DNA histonu H1 ze strukturą domeny wiążącej DNA czynnika transkrypcyjnego HNF-3 (Clark i wsp., 1993).

2.2.4.1 Ogólna represja transkrypcji przez H1 w układach in vitro

Histon H1 zaangażowany jest w formowanie włókna 30 nm i wyższych struktur chromatynowych, które poważnie utrudniają transkrypcję. Z tego powodu H1 można uznać za czynnik determinujący powstawanie nieaktywnych transkrypcyjnie obszarów chromatyny. Już wczesne doniesienia wskazywały, że H1 wiąże się w odmienny sposób w aktywnych transkrypcyjnie rejonach chromatyny niż w obszarach wyciszonych (Weintraub, 1984). W układach in vitro histon H1 zachowuje się jak ogólny represor transkrypcji zarówno wtedy, gdy matrycą jest nagi DNA, jak również w przypadku matryc chromatynowych, z których wcześniej usunięto H1 (zob. niżej). Represja transkrypcji skorelowana jest ze zdolnością H1 do indukowania struktur wyższego rzędu, w których polimeraza i czynniki trans mają ograniczony dostęp do DNA (Hannon i wsp., 1984).

W układzie in vitro z plazmidem niosącym 18 kopii genu 5S RNA jeżowca Lytechinus variegatus badano transkrypcję z użyciem polimerazy RNA z faga T7 (O’Neill i wsp., 1992; O’Neill i wsp., 1995). Uzyskane wyniki pokazują, że histon H1 blokuje transkrypcję z nagiego DNA oraz jeszcze silniej z matryc chromatynowych. Hamowaniu podlega zarówno proces inicjacji jak i elongacji transkrypcji, a mechanizm polega w każdym przypadku na indukowaniu struktur chromatyny nieaktywnych transkrypcyjnie (O’Neill i wsp., 1995). Usunięcie H1 przywraca aktywność transkrypcyjną w chromatynie zrekonstruowanej in vitro, a utworzenie stabilnych kompleksów transkrypcyjnych zapobiega represji przez H1 (Shimamura i wsp., 1989).

Istnieją dane wskazujące, że wbudowanie histonu H1 do sztucznej chromatyny rekonstruowanej na plazmidowym DNA powoduje spadek syntezy RNA przez polimerazę II do wartości 1-4 % w stosunku do poziomu transkrypcji z nagiego DNA (Laybourn i Kadonaga, 1991). Mechanizm represji polega tu prawdopodobnie na blokowaniu miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych i pozostaje w dynamicznej równowadze z procesem wiązania antyrepresorów (np. czynników Sp1, GAL4-VP16 i GAGA) konkurujących z H1 o dostęp do tych miejsc (Crosten i wsp., 1991; Pazin i wsp., 1994).

Zbadano również efekt histonu H1 na zależną od ATP reorganizację struktury chromatyny w obszarze promotora genów szoku cieplnego u Drosophila. H1 osłabia (choć nie znosi całkowicie) wiązanie czynnika GAGA i zmniejsza dostępność DNA dla endonukleaz restrykcyjnych w promotorach genów hsp26 i hsp70 (Tsukiyama i wsp., 1994; Varga-Weisz i wsp., 1995) (por. Wstęp, rozdział 2.2.1.2). Stwierdzono również, że dodanie H1 ogranicza ruchliwość nukleosomów i hamuje transkrypcję przez polimerazę RNA III (Ura i wsp., 1995).

2.2.4.2 Specyficzna regulacja transkrypcji genów przez histon H1 w układach in vivo

Działanie H1 jako specyficznego regulatora transkrypcji genów zostało najlepiej poznane w związku z ekspresją genów 5S RNA u Xenopus laevis. Profil transkrypcji genów 5S RNA zmienia się w rozwoju embrionalnym Xenopus. W początkowych fazach rozwoju transkrybowane są dwie rodziny tych genów: geny oocytarne, które występują w około 20000 kopii na genom haploidalny, i geny somatyczne, których rodzina składa się z około 400 powtarzających się jednostek (Wolffe, 1994b). Pojedyncza jednostka oocytarna zawiera gen 5S RNA o długości 120 par zasad oraz niefunkcjonalny pseudogen. Od strony 5’ gen poprzedzony jest sekwencją oskrzydlającą o różnej długości (360-570 par zasad), która - podobnie jak odcinek między genem a pseudogenem - jest bogata w nukleotydy adeninowe i tyminowe (pary AT) (Korn i Brown, 1978; Peterson i wsp., 1980). Jednostka somatyczna zbudowana jest z genu 5S RNA długości 120 par zasad sąsiadującego od strony 5’ z sekwencją długości około 600 par zasad i od strony 3’ z fragmentem około 80 par zasad, obydwie sekwencje są bogate w nukleotydy guaninowe i cytozynowe (pary GC). Somatyczny gen 5S RNA różni się od oocytarnego zaledwie 8 mutacjami punktowymi (Peterson i wsp., 1980).

Począwszy od stadium późnej gastruli transkrypcja oocytarnych jednostek genu 5S RNA jest wyłączona, podczas gdy geny somatyczne pozostają aktywne do końca życia organizmu. Przez długi czas brano pod uwagę dwie hipotezy wyjaśniające mechanizm wyłączania genów 5S RNA. Pierwsza z nich przypisywała histonowi H1 rolę represora transkrypcji tych genów, a jej potwierdzeniem miały być wyniki badań in vitro, w których wykazano, że do represji oocytarnych genów 5S RNA niezbędny jest H1 (Schlissel i Brown, 1984), oraz obserwacje, że wyłączenie transkrypcji oocytarnegu genu 5S jest skorelowane w czasie z pojawieniem się u Xenopus somatycznego wariantu histonu H1, który zaczyna być akumulowany dopiero podczas embriogenezy (Smith i wsp., 1988; Chipev i Wolffe, 1992; Dworkin-Rastl i wsp., 1994), a nie ma go w oocytach (Dimitrov i wsp., 1993). Druga z hipotez zakładała, że przyczyną hamowania transkrypcji badanych genów jest deficyt czynnika transkrypcyjnego TFIIIA, a jej potwierdzeniem mogły być wyniki badań, w których po sztucznym podniesieniu stężenia TFIIIA w zarodkach Xenopus uzyskiwano krótkotrwałą aktywację transkrypcji oocytarnych genów 5S RNA (Andrews i Brown, 1987). Dopiero jednak doświadczenie in vivo, w którym odblokowano wyłączone oocytarne geny 5S RNA, eliminując ekspresję H1 przy pomocy specyficznego rybozymu (Kandolf, 1994), oraz doświadczenie polegające na wyłączeniu ekspresji aktywnego oocytarnego genu 5S w zarodkach Xenopus przez sztucznie podniesienie poziomu histonu H1 w obecności TFIIIA (Bouvet i wsp., 1994), potwierdziły rolę histonu H1 w selektywnej represji transkrypcji genów 5S RNA u Xenopus.

Istniało kilka innych hipotez wyjaśniających mechanizm regulacji transkrypcji tych genów. Sugerowano między innymi, że aktywne geny somatyczne 5S RNA mogą ulegać replikacji wcześniej (gdy obecne są czynniki transkrypcyjne) niż nieaktywne jednostki oocytarne (Gottesfeld i Bloomer, 1982; Wormington i wsp., 1982), jak również przypisywano czynnikowi TFIIIA różnice w wiązaniu się do jednostki oocytarnej i somatycznej (Kmiec i wsp., 1986; Blanco i wsp., 1989).

Dalsze próby wyjaśnienia mechanizmu selektywnej represji genów 5S RNA doprowadziły do znalezienia różnic w strukturze chromatyny tych genów. Okazało się, że in vivo nieaktywne oocytarne jednostki genu 5S zorganizowane są w luźno spozycjonowane nukleosomy i są chronione przed działaniem nukleaz, podczas gdy aktywne geny somatyczne są dostępne dla enzymów i nie wykazują struktury nukleosomowej. Stwierdzono, że odpowiedzialny za ustalanie nukleosomowej struktury chromatyny w obszarze oocytarnych jednostek 5S RNA jest histon H1 (Chipev i Wolffe, 1992). Z kolei w badaniach in vitro wykazano, że zamiana sekwencji oskrzydlających pomiędzy genami obu typów powoduje analogiczną zamianę wzoru represji transkrypcji tych genów przez histon H1; wyłączanie transkrypcji obydwu typów genów zachodziło wtedy, gdy były one w otoczeniu sekwencji bogatych w pary AT, pochodzących z jednostki oocytarnej genu 5S. Pokazano, że przyczyna represji transkrypcji tkwi w selektywnym wiązaniu się histonu H1 do sekwencji AT-bogatych otaczających oocytarny gen 5S RNA (Jerzmanowski i Cole, 1990).

Histon H1 narzuca więc stan stabilnej represji w obszarze oocytarnego genu 5S RNA, oddziałując z odcinkami bogatymi w pary AT (Jerzmanowski i Cole, 1990). In vivo efekt H1 przejawia się w postaci znacznych różnic w strukturze chromatyny między dwoma typami genów 5S (Chipev i Wolffe, 1992). Nieznany jest jednak mechanizm kierowanego przez H1 procesu reorganizacji struktury chromatyny w wyniku oddziaływań histonu z AT-bogatymi sekwencjami, w szczególności nie wiadomo, jakiej długości musi być obszar bogaty w AT i na jaką odległość od genu może działać.

Niedawne doświadczenia z dysrupcją genów kodujących histon H1 u pierwotniaka Tetrahymena thermophila pokazały, że H1 może również odgrywać rolę selektywnego aktywatora transkrypcji. Zidentyfikowano gen CyP, którego transkrypcja jest hamowana pod nieobecność H1 (Shen i Gorovsky, 1996). Z tego powodu histon H1 określa się jako specyficzny regulator (pozytywny lub negatywny) ekspresji wybranych genów u Eukaryota.

Nie jest natomiast H1 ogólnym represorem transkrypcji genów w układach in vivo. Doświadczenia z transgenicznymi roślinami tytoniu, w których następowała całkowita wymiana endogennego histonu H1 na H1 kodowany przez obcy gen, pokazały, że histonu H1 nie należy uznawać za globalny represor transkrypcji in vivo, można natomiast przypisać mu udział w kontrolowaniu specyficznych programów rozwojowych (Prymakowska-Bosak i wsp., 1996). Również z prac nad dysrupcją genów kodujących H1 u Tetrahymena thermophila wynika, że obniżenie poziomu H1 nie prowadzi do istotnych zmian profilu transkrypcji genów zależnych od polimeraz RNA I i III (Shen i Gorovsky, 1996). Histon H1 zwiększa jedynie stopień upakowania materiału genetycznego, biorąc udział w tworzeniu struktur wyższego rzędu w chromatynie (Shen i wsp., 1995).


3. BADANIA IN VITRO

3.1 REKONSTYTUCJA CHROMATYNY

W komórce proces składania chromatyny jest sprzężony z replikacją DNA (Almouzni i Wolffe, 1993). Najpierw odkładane są tetramery histonów H3/H4, następnie dimery H2A-H2B oraz histon H1, który wiąże się jako ostatni (Wolffe, 1991; Wolffe, 1994). Część puli histonów H1, H2A i H2B jest syntetyzowana i włączana do chromatyny w procesie aktywnej wymiany (Louters i Chalkley, 1985). W układach in vitro nukleosomy można rekonstruować dwoma sposobami: w systemie związanym z replikacją DNA (Mé chali i Harland, 1982) lub niezależnie od replikacji (zob. rozdziały 3.1.1 i 3.1.2). Aby uzyskać poprawną rekonstrukcję chromatyny, konieczne jest spełnienie dwóch kryteriów: po pierwsze, musi dojść do powstania podstawowej jednostki strukturalnej chromatyny poprzez nawinięcie nici DNA wokół oktameru histonowego, po drugie, zrekonstruowane w ten sposób nukleosomy muszą zostać regularnie rozmieszczone na DNA. Chromatynę, która spełnia obydwa kryteria, otrzymuje się in vitro stosując dwie grupy metod: albo rekonstytucję w nieoczyszczonych ekstraktach wolnokomórkowych (ang. crude cell-free extracts) (zob. rozdział 3.1.1) będących źródłem endogennych histonów, albo rekonstytucję z czystych składników (ang. pure components) (zob. rozdział 3.1.2). Uzyskiwane odległości między oktamerami w chromatynie zrekonstruowanej in vitro zbliżone są do naturalnych (Stein, 1996).

3.1.1 Rekonstytucja przy pomocy nieoczyszczonych ekstraktów wolnokomórkowych

Po raz pierwszy sztuczną chromatynę uzyskano w ekstraktach Xenopus, wykorzystując do tego celu supernatant zawierający endogenne histony. Po wprowadzeniu do takiego układu DNA wirusa SV40 (o długości 5243 par zasad) DNA tworzyło strukturę nukleoproteinową tworząc tzw. minichromosom (Laskey i wsp., 1977). Następne udane próby przeprowadzono z supernatantem S-150 z oocytów Xenopus (Rodriguez-Campos i wsp., 1989). Ponieważ ekstrakt z oocytów nie zawiera histonu H1, do układu musi być dodawany H1 egzogenny, którego ilość ma wpływ na odległości między nukleosomami. W latach 90-ych opracowano również systemy rekonstytucji chromatyny w oparciu o ekstrakty z zarodków Drosophila, zawierające endogenną pulę histonów (Becker i Wu, 1992; Kamakaka i wsp., 1993).

Badania mechanizmu rekonstytucji chromatyny in vitro doprowadziły do zidentyfikowania nukleoplazminy - czynnika odpowiedzialnego za odkładanie nukleosomów (ang. nucleosome assembly factor) (Laskey i wsp., 1978; Earnshaw i wsp., 1980), oraz kolejnych czynników N1/N2 (Kleinschmidt i Franke, 1982; Kleinschmidt i wsp., 1986) (por. Wstęp, rozdział 1.1). Wykazano, że istotną rolę w procesie składania chromatyny pełni również deacetylacja histonu H4 (Shimamura i Worcel, 1989) oraz aktywność topoizomerazy I (Sekiguchi i Kmiec, 1988). Z kolei topoizomeraza II, która jest nieodzowna w tworzeniu struktur chromatyny wyższego rzędu związanych z kondensacją chromosomów w mitozie (Adachi i wsp., 1991; Hirano i Mitchison, 1991), nie jest konieczna do powstawania nukleosomów (Almouzni i Mé chali, 1988). Jednak niedawno wysunięto przypuszczenie, że topoizomeraza II musi brać udział w rozpętlaniu i relaksacji DNA przed uformowaniem nukleosomu (Rodriguez-Campos, 1996).

W znacznie mniejszym stopniu poznano mechanizmy rekonstytucji in vitro związane z replikacją cząsteczek DNA (Mé chali i Harland, 1982; Almouzni i wsp., 1990b).

Zaletą wszystkich powyższych systemów jest ich niezawodność, natomiast za wadę należy uznać zanieczyszczenie ekstraktów dużymi ilościami białek i aktywności enzymatycznych, których nie da się kontrolować.

3.1.2 Rekonstytucja z czystych składników

Metody rekonstytucji chromatyny in vitro opierają się na stopniowym obniżaniu stężenia soli w roztworze, w którym DNA i histony nie oddziałują ze sobą (powyżej 1.2 M NaCl) aż do uzyskania stężeń fizjologicznych, w których histony wiążą się z DNA (Oudet i wsp., 1975; Hansen i wsp., 1991). Zrekonstruowana chromatyna ma strukturę nieregularną, a produktem trawienia uzyskanego w ten sposób minichromosomu są fragmenty DNA równe całkowitej wielokrotności 150 par zasad. Dodanie H1 do takiego układu prowadzi do niespecyficznej agregacji, gdyż H1 oddziałuje kooperacyjnie z nieosłoniętymi odcinkami DNA (Stein, 1989; Dimitrov i Wolffe, 1995). Stosowane metody pozwalają na przeciwdziałanie agregacji histonów z DNA.

3.1.2.1 Systemy oparte na kwasie poliglutaminowym

Kwas poliglutaminowy (ang. polyglutamic acid, PGA) oraz jego sól sodowa są polianionami zaangażowanymi w osłabianie niespecyficznych agregacji białek i DNA podczas rekonstrukcji minichromosomów. Związki te pełnią funkcję analogiczną do roli nukleoplazminy in vivo (por. rozdział 3.1.1), kontrolując dołączanie heterodimerów H2A-H2B do formowanego nukleosomu (Krude i Elgin, 1996). PGA umożliwia także histonowi H1 organizowanie regularnej struktury nukleosomowej na DNA, głównie dzięki wyższemu powinowactwu H1 do nukleosomów niż do nagiego DNA (Hayes i Wolffe, 1993). Mechanizm reorganizacji nukleosomów przez histon H1 pozostaje jednak nieznany, gdyż nie jest do końca wiadomo, w jaki sposób H1 oddziałuje z oktamerem. In vitro zaobserwowano wyraźne preferencje histonów łącznikowych do miejsc krzyżowania się dwuniciowego DNA (ang. crossovers) (Krylov i wsp., 1993). Preferencje te mogą przemawiać za modelem, w którym histon H1 spina DNA wchodzące i schodzące z oktameru i w ten sposób, zwiększając długość DNA nawiniętego na rdzeń, rozsuwa nuklesomy (Stein, 1996). Z kolei asymetryczne wiązanie histonu H1/H5 do nukleosomowego DNA oraz częściowo do DNA linkera (Hayes i wsp., 1994; Pruss i wsp., 1996) może prowadzić do usztywnienia DNA w obszarze łącznikowym i w rezultacie do odwinięcia DNA z nukleosomów oraz do ich przemieszczenia (Stein, 1996).

3.1.2.2 Systemy oparte na syntetycznych fragmentach DNA

In vitro poprawnie zrekonstruowaną chromatynę z nukleosomami odległymi o 210 ą 5 par zasad łatwo się uzyskuje na syntetycznych sekwencjach typu poli(dA-dT) w obecności PGA. Decydującą rolę w rozsuwaniu upakowanych na DNA cząstek rdzeniowych przypisuje się histonom H5/H1, bowiem pod ich nieobecność nukleosomy nie tworzą uporządkowanych struktur (Stein i Bina, 1984). Łatwość rekonstytucji chromatyny na sekwencjach poli(dA-dT) tłumaczy się wysokim ich powinowactwem do H1 oraz wyeliminowaniem przez nie innych sekwencji, wobec których nukleosomy mogłyby wykazywać preferencje.

3.1.2.3 Systemy oparte na naturalnych sekwencjach pozycjonujących nukleosomy

W genomie eukariotycznym prawdopodobnie istnieją sygnały decydujące o sposobie rozmieszczenia nukleosomów w chromatynie (Simpson, 1991; Stein, 1996). Zidentyfikowano kilka takich sygnałów i zaczęto je stosować w układach in vitro jako tzw. sekwencje „pozycjonujące” nukleosomy i reorganizujące strukturę chromatyny. Pierwszą znalezioną sekwencją tego typu był fragment genu 5S rRNA jeżowca Lytechinus variegatus, który zawiera silny sygnał pozycjonujący dla oktameru histonowego (Gottesfeld, 1987). Wykazano, że po dodaniu histonów H1/H5 plazmid niosący kilkanaście powtórzeń tego genu zdolny jest do regularnego rozmieszczania nukleosomów (ang. alignment) na sekwencjach 5S rDNA (Simpson i wsp., 1985; Meersseman i wsp., 1991). Podobne właściwości, polegające na zdolności rozsuwania ciasno upakowanych nukleosomów po włączeniu H5, zaobserwowano dla intronów w genie owoalbuminy kurzej, które w testowanym układzie in vitro rozsuwały nukleosomy na odległość 196 par zasad (Lauderdale i Stein, 1992), dla kurzego genu beta-globiny (odpowiednio 180 par zasad) (Liu i wsp., 1993) oraz dla intronów w szczurzym genie hormonu wzrostu (odpowiednio 195 par zasad) (Liu i wsp., 1995). W bakteryjnym plazmidzie pBR327 (o długości 3274 par zasad) zidentyfikowano obszar COR (ang. chromatin organizing region) odpowiedzialny za pozycjonowanie i reorganizację nukleosomów w obecności histonów H1/H5 (Jeong i wsp., 1991). Zaproponowano mechanizm rozsuwania oktamerów polegający na pozycjonowaniu 2 nukleosomów co 210 par zasad w obrębie COR, a następnie rozprzestrzenianiu się tego regularnego układu na sąsiednie obszary plazmidu. Poddano analizie kilkadziesiąt konstrukcji plazmidowych pod kątem ich przydatności do rekonstrukcji chromatyny in vitro. Uzyskane dane wskazują, że matryce do rekonstytucji oparte na pochodnych plazmidu pBR327 muszą dodatkowo spełniać następujące warunki: ich długość powinna być równa całkowitej wielokrotności 210 ą 3 par zasad oraz nie mogą mieć naruszonej ciągłości obszaru COR (Lauderdale i Stein, 1993).

3.2 TRANSKRYPCJA IN VITRO

W doświadczeniach stosuje się kilka metod badania transkrypcji danego genu: system wykorzystujący oocyty X. laevis polega na wstrzyknięciu DNA do oocytu Xenopus i uzyskaniu transkrypcji, w systemach transfekcji wprowadza się egzogenny DNA do hodowli komórkowej i uzyskuje krótkotrwałą (ang. transient assay) lub długotrwałą (ang. stable) ekspresję genu, systemy transgeniczne polegają na wprowadzeniu genu do linii zarodkowej zwierzęcia i uzyskaniu w niej ekspresji takiego transgenu, system in vitro polega na otrzymaniu transkryptu w ściśle kontrolowanych warunkach w probówce (Lewin, 1997).

Metoda transkrypcji in vitro jest najszybszym testem poziomu transkrypcji badanego genu, pozwalającym na dokonywanie zmian w sekwencjach DNA oraz w składzie białek regulatorowych. Technika ta umożliwia m. in. badanie selektywnej regulacji inicjacji transkrypcji (Gorski i wsp., 1986), identyfikację białek zaangażowanych w regulację ekspresji (Hirai i wsp., 1986), jak również prowadzenie badań z zastosowaniem rekonstytuowanej chromatyny (Nakanishi i wsp., 1986).

Znane są dwa systemy transkrypcji in vitro: pierwszy opiera się na ekstraktach sporządzonych z całych komórek (ang. whole cell extracts, WCE) lub jąder komórkowych (ang. nuclear extracts) (Manley i wsp., 1983; Dignam i wsp., 1983a), w drugim stosuje się oczyszczone czynniki transkrypcyjne i polimerazy RNA (Dignam i wsp., 1983b). Do przygotowania ekstraktów transkrypcyjnych typu WCE używa się zwykle komórek z linii nowotworowej HeLa lub komórek raka Ehrlicha (Dignam i wsp., 1983a), jak również z tkanki mózgowej i wątroby ssaków (Gorski i wsp., 1986). Gotowy ekstrakt jest źródłem polimeraz RNA i czynników transkrypcyjnych.

Transkrypcja wykorzystująca oczyszczone składniki jest trudniejsza do przeprowadzenia ze względu na problemy z przygotowaniem czynników transkrypcyjnych i polimeraz w stopniu czystości dającym gwarancję pełnej kontroli składu mieszaniny.


Literatura

Adachi Y., Luke M. i Laemmli U. K. (1991). Chromosome assembly in vitro: topoisomerase II is required for condensation. Cell 64, 137-148

Adams C. C. i Workman J. L. (1993). Nucleosome Displacement in Transcription. Cell 72, 305-308

Almer A. i Hö rz W. (1986). Nuclease hypersensitive regions with adjacent positioned nucleosomes mark the gene boundaries of the PHO5/PHO3 locus in yeast. EMBO J. 5, 2681-2687

Almer A., Rudolph H., Hinnen A. i Hö rz W. (1986). Removal of positioned nucleosomes from the yeast PHO5 promoter upon PHO5 induction releases additional activating DNA elements. EMBO J. 5, 2689-2696

Almouzni G. i Mé chali M. (1988). Assembly of spaced chromatin: involvement of ATP and DNA topoisomerase activity. EMBO J. 7, 4355-4365

Almouzni G., Mé chali M i Wolffe A. P. (1990a). Competition between transcription complex assembly and chromatin assembly on replicating DNA. EMBO J. 9, 573-582

Almouzni G., Clark D. J., Mé chali M i Wolffe A. P. (1990b). Chromatin assembly on replicating DNA in vitro. Nucl. Acids Research 18, 5767-5773

Almouzni G. i Wolffe A. P. (1993). Replication-coupled chromatin assembly is required for the repression of basal transcription in vivo. Genes Dev. 7, 2033-2047

Andrews M. T. i Brown D. D. (1987). Transient activation of oocyte 5S RNA genes in Xenopus embryos by raising the level of the trans-acting factor TFIIIA. Cell 51, 445-453

Archer T. K., Lefebvre P., Wolford R. G. i Hager G. L. (1992). Transcription factor loading on the MMTV promoter: a bimodal mechanism for promoter activation. Science 255, 1573-1576

Arents G. i Moudrianakis E. W. (1993). Topography of histone octamer surface: repeating structural motifs utilized in the docking of nucleosomal DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10489-10493

Arents G. i Moudrianakis E. W. (1995). The histone fold: A ubiquitous architectural motif utilized in DNA compaction and protein dimerization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11170-11174

Axelrod J. D., Reagan M. S. i Majors J. (1993). GAL4 disrupts a repressing nucleosome during activation of GAL1 transcription in vivo. Genes Dev. 7, 857-869

Bannister A. J. i Kouzarides T. (1996). The CBP co-activator is a histone acetyl-transferase. Nature 384, 641-643

Becker P. B. i Wu C. (1992). Cell-free system for assembly of transcriptionally repressed chromatin from Drosophila embryos. Mo. Cell. Biol. 12, 2241-2249

Bellard M., Dretzen G., Giangrande A. i Ramain P. (1989). Nuclease Digestion of Transcriptionally Active Chromatin. W: Methods Enzymol. 170, 317-346 (Wassarman P. M., Kornberg R. D., eds.) Academic Press

Berkner K. L. i Folk W. R. (1977). Polynucleotide kinase exchange reaction. Quantitative assay for restriction endonuclease-generated 5’-phosphoryl termini in DNAs. J. Biol. Chem. 252, 3176-3180

Blanco J., Millstein L., Razik M. A., Dilworth S., Cote C. i Gottesfeld J. (1989). Two TFIIIA activities regulate expression of the Xenopus 5S RNA gene families. Genes Dev. 3, 1602-1612

Bouvet P., Dimitrov S. i Wolffe A. P. (1994). Specific regulation of Xenopus chromosomal 5S rRNA gene transcription in vivo by histone H1. Genes Dev. 8, 1147-59

Bowater R., Aboul-Ela F. i Lilley D. M. J. (1992). Two-Dimensional Gel Electrophoresis of Circular DNA Topoisomers. W: Methods Enzymol. 212, 105-120 (Lilley D. M. J., Dahlberg J. E., eds.) Academic Press

Bradford M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of proteins utilizing the principle of protein dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254

Breeden L. i Nasmyth K. (1987). Cell cycle control of the yeast HO gene: cis- and trans-acting regulators. Cell 48, 389-397

Bresnick E. H., Bustin M., Marsaud V., Richard-Foy i Hager G. L. (1992). The transcriptionally-active MMTV promoter is depleted of histone H1. Nucleic Acids Res. 20, 273-278

Brownell J. E., Zhou J., Ranalli T., Kobayashi R., Edmondson D. G., Roth S. Y. i Allis C. D. (1996). Tetrahymena histone acetyltransferase A: a homolog to yeast Gcn5p linking histone acetylation to gene activation. Cell 84, 843-851

Buratowski S. (1994). The Basics of Basal Transcription by RNA Polymerase II. Cell 77,1-3

Buratowski S., Hahn S., Guarente L. i Sharp P. A. (1989). Five intermediate complexes in transcription initiation by RNA polymerase II. Cell 56, 549-561

Burley S. K. (1996). Biochemistry and structural biology of transcription factor IID. Ann. Rev. Biochem. 65, 769-799

Calikowski T. (1995). Rekonstrukcja matryc nukleosomowych do badania transkrypcji in vitro. Praca magisterska, Pracownia Biologii Molekularnej Roślin UW, 24-29. Warszawa

Cary P. D., Crane-Robinson C., Bradbury E. M. i Dixon G. H. (1982). Effect of acetylation on the binding of N-terminal peptides of histone H4 to DNA. Eur. J. Biochem. 127, 137-143

Cavalli G. i Thoma F. (1993). Chromatin transitions during activation and repression of galactose-regulated genes in yeast. EMBO J. 12, 4603-4613

Chamberlain J. S i Chamberlain J. R. (1994). Optimization of Multiplex PCRs. W: The Polymerase Chain Reaction, 38-46 (Mullis K. B., Ferré F., Gibbs R. A., eds) Birkhauser, Boston

Chen H., Lin R. J., Schiltz R. L., Chakravarti D., Nash A., Nagy L., Privalsky M. L., Nakatani Y. i Evans R. M. (1997). Nuclear receptor coactivator ACTR is a novel histone acetyltransferase and forms a multimeric activation complex with P/CAF and CBP/p300. Cell 90, 569-580

Chipev C. C. i Wolffe A. P. (1992). Chromosomal Organization of Xenopus laevis Oocyte and Somatic 5S rRNA Genes In Vivo. Mol. Cell. Biol. 12, 45-55

Chytil M. i Verdine G. L. (1996). The Rel family of eukaryotic transcription factors. Cur. Opin. Struc. Bio. 6, 91-100

Clark D. J. i Felsenfeld G. (1992). A nucleosome core is transferred out of the path of a transcribing polymerase. Cell 71, 11-22

Clark D. J., Halay E. D., Lai E. i Burley S. K. (1993). Co-crystal structure of the HNF3/fork head DNA-recognition motif resembles histone H5. Nature 364, 412-420

Cole R. D. (1989). Purification and Analysis of H1 Histones. W: Methods Enzymol. 170, 524-531 (Wassarman P. M., Kornberg R. D., eds.) Academic Press

Cooper J. P., Roth S. Y. i Simpson R. T. (1994). The global transcriptional regulators, SSN6 and TUP1, play distinct roles in the establishment of a repressive chromatin structure. Genes Dev. 8, 1400-1410

Cordingley M. G., Riegel A. T. i Hager G. L. (1987). Steroid dependent interaction of transcription factors with the inducible promoter of the mouse mammary tumor virus in vivo. Cell 48, 261-270

Cô té J., Quinn J., Workman J. L. i Peterson C. L. (1994). Stimulation of GAL4 derivative binding to nucleosomal DNA by the yeast SWI/SNF complex. Science 265, 53-60

Croston G. E., Kerrigan L. A., Lira L. M., Marshak D. R. i Kadonaga J. T. (1991). Sequence-Specific Antirepression of Histone H1-Mediated Inhibition of Basal RNA Polymerase II Transcription. Science 251, 643-648

Currie R. A. (1998). NF-Y Is Associated with the Histone Acetyltransferases GCN5 and P/CAF. J. Biol. Chem. 273, 1430-1434

Dagert H. i Ehrlich S. (1979). Prolonged incubation in calcium chloride improves the competence of E.coli cells. Gene 6, 23-28

Dignam J. D., Lebovitz R. M. i Roeder R. G. (1983a). Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids
Res. 11, 1475-1489

Dignam J. D., Martin P. L., Shastry B. S. i Roeder R. G. (1983b). Eukaryotic Gene Transcription with Purified Components. W: Methods Enzymol. 101, 582-598 (Wu R., Grossman L., Moldave K., eds.) Academic Press

Dimitrov S., Almouzni G., Dasso M. i Wolffe A. P. (1993). Chromatin transitions during early Xenopus embryogenesis: changes in histone H4 acetylation and in linker histone type. Develop. Biol. 160, 214-227

Dimitrov S. i Wolffe A. P. (1995). Chromain and nuclear assembly: experimental approaches towards the reconstitution of transcriptionally active and silent states. Biochim. Biophys. Acta 1260, 1-13

Duband-Goulet I., Carot V., Ulyanov A. V., Douc-Rasy S. i Prunell A. (1992). Chromatin Reconstitution on Small DNA Rings. IV. DNA Supercoiling and Nucleosome Sequence Preference. J. Mol. Biol. 224, 981-1001

Durrin L. K., Mann R. K., Kayne P. S. i Grunstein M. (1991). Yeast histone H4 N-terminal sequence is required for promoter activation in vivo. Cell 65, 1023-1031

Dworkin-Rastl E., Kandolf H. i Smith R. C. (1994). The maternal histone H1 variant, H1M (B4 protein), is the predominant H1 histone in Xenopus pregastrula embryos. Dev. Biol. 161, 425-439

Earnshaw W. C., Honda B. M., Mills A. D. i Thomas J. O. (1980). Assembly of nucleosomes: the reaction involving Xenopus laevis nucleoplasmin. Cell 21, 373-383

Edmondson D. G., Smith M. M. i Roth S. Y. (1996). Repression domain of the yeast global repressor TUP1 interacts directly with histones H3 and H4. Genes Dev. 10, 1247-1259

Edwards D. R., Rocheleau H., Sharma R. R., Wills A. J., Cowie A.Hassell J. A. i Heath J. K. (1992). Involvement of AP1 and PEA3 binding sites in the regulation of murine tissue inhibitor of metalloproteinases-1 (TIMP-1) transcription. Biochim. Biophys. Acta 1171,41-55

Elfring L. K., Deuring R., McCallum C. M., Peterson C. L. i Tamkun J. W. (1994). Identification and characterization of Drosophila relatives of the yeast transcriptional activator SNF2/SWI2. Mol. Cell. Biol. 14, 2225-2234

Fan H. i Sugiura M. (1995). A plant basal in vitro system supporting accurate transcription of both RNA polymerase II- and III-dependent genes: supplement of green leaf component(s) drives accurate transcription of a light-responsive rbcS gene. EMBO J. 14, 1024-1031

Fascher K. D., Schmitz J. i Hö rz W. (1990). Role of trans-activating proteins in the generation of active chromatin at the PHO5 promoter in S. cerevisiae. EMBO J. 9, 2523-2528

Felsenfeld G. (1978). Chromatin. Nature 271, 115-122

Felsenfeld G. (1992). Chromatin as an essential part of the transcriptional mechanism. Nature 355, 219-223

Felsenfeld G., Boyes J., Chung J., Clark D. i Studitsky V. (1996). Chromatin structure and gene expression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 9384-9388

Fukuma M., Hiraoka Y., Sakurai H. i Fukasawa T. (1994). Purification of Yeast Histones Component for Nucleosome Assembly in Vitro. Yeast 10, 319-331

Garfin D. E. (1990). One-Dimensional Gel Elektrophoresis. W: Methods Enzymol. 182, 425-441 (Deutscher M. P., ed.) Academic Press

Geiduschek E. P. i Tocchini-Valentini G. P. (1988). Transcription by RNA Polymerase III. Ann. Rev. Biochem. 57, 873-914

Geise K., Cox J., Grosschedl R. (1992). The HMG domain of lymphoid enhancer factor 1 bends DNA and facilitates assembly of functional nucleoprotein structures. Cell 69, 185-191

Georgel P. T., Tsukiyama T. i Wu C. (1997). Role of histone tails in nucleosome remodeling by Drosophila NURF. EMBO J. 16, 4717-4726

Germond J. E., Hirt B., Oudet P., Gross-Bellard M. i Chambon P. (1975). Folding of the DNA double helix in chromatin-like structures from SV40. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 1843-1847

Gorski K., Carneiro M. i Schibler U. (1986). Tissue-specific in vitro transcription from the mouse albumin promoter. Cell 47, 767-776

Gottesfeld J. M. (1987). DNA sequence-directed nucleosome reconstitution on 5S RNA genes of Xenopus laevis. Mol. Cell. Biol. 7, 1612-1622

Gottesfeld J. M. (1989). Analysis of RNA Polymerase III Transcription Using Chromatin and Cloned Gene Templates. W: Methods Enzymol. 170, 347-359 (Wassarman P. M., Kornberg R. D., eds.) Academic Press

Gottesfeld J. M. i Bloomer L. S. (1982). Assembly of transcriptionally active 5S RNA gene chromatin in vitro. Cell 28, 781-791

Grunstein M. (1990). Nucleosomes: regulators of transcription. Trends Genet. 6, 395-400

Han M. i Grunstein M. (1988). Nucleosome Loss Activates Yeast Downstream Promoter In Vivo. Cell 55, 1137-1145

Hannon R., Bateman E., Allan J., Harborne N. i Gould H. (1984). Control of RNA Polymerase Binding to Chromatin by Variations in Linker Histone Composition. J. Mol. Biol. 180, 131-149

Hansen J. C., van Holde K. E. i Lohr D. (1991). The Mechanism of Nucleosome Assembly onto Oligomers of the Sea Urchin 5S RNA Positioning Sequence. J. Biol. Chem. 266, 4276-4282

Haupt Y., Alexander W. S., Barri G., Klinken S. P. i Adams J. M. (1991). Novel zinc finger gene implicated as myc collaborator by retrovirally accelerated lymphomagenesis in Em-myc transgenic mice. Cell 65, 753-763

Hawley D. K. i Roeder R. G. (1987). Functional steps in Transcription Initiation and Reinitiation from the Major Late Promoter in a HeLa Nuclear Extract. J. Biol. Chem. 262, 3452-3461

Hayes J. J., Tullius T. D. i Wolffe A. P. (1990). The structure of DNA in the nucleosome. Proc. Natl. Acad. Sci USA 87, 7405-7409

Hayes J. J. i Wolffe A. P. (1993). Preferential and asymmetric interaction of linker histones 5S DNA in the nucleosome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6415-6419

Hayes J. J., Pruss D. i Wolffe A. P. (1994). Contacts of the globular domain of histone H5 and core histones with DNA in a „chromatosome". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 7817-21

Hecht A., Laroche T., Strahl-Bolsinger S., Gasser S. M. i Grunstein M. (1995). Histone H3 and H4 N-termini interact with SIR3 and SIR4 proteins: A molecular model for the formation of heterochromatin in yeast. Cell 80, 583-592

Heierman R. i Pongs O. (1985). In Vitro transcription with extracts of nuclei of Drosophila embryos. Nucleic Acids Res. 13, 2709-2730

Hirai H., Ohtsuki M., Nakanishi I., Horikoshi M., Tanaka N. i Natori S. (1986). Transcription factor(s) of Ehrlich ascites tumor cells having affinity to the ‘TATA’ box and a further upstream region of the adenovirus 2 major late gene. Biochim. Biophys. Acta 868, 243-248

Hirano T. i Mitchison T. J. (1991). Cell cycle control of higher-order chromatin assembly around naked DNA in vitro. J. Cell. Biol. 115, 1479-1489

Hirschhorn J. N., Brown S. A., Clark C. D. i Winston F. (1992). Evidence that SNF2/SWI2 and SNF5 activate transcription in yeast by altering chromatin structure. Genes Dev. 6, 2288- 2298

Hirschhorn J. N., Bortvin A. L., Ricupero-Hovasse S. L. i Winston F. (1995). A new class of histone H2A mutations in Saccharomyces cerevisiae causes specific transcriptional defects in vivo. Mol. Cell. Biol. 15, 1999-2009

Holstege F. C., van der Vliet P. C. i Timmers H. T. (1996). Opening of an RNA polymerase II promoter occurs in two distinct steps and requires the basal transcription factors IIE and IIH. EMBO J. 15, 1666-1677

Hoyer-Fender S. i Grossbach U. (1988). Histone H1 heterogeneity in the midge, Chironomus thumni. Eur. J. Biochem. 176, 139-152

Imbalzano A. N., Kwon H., Green M. R. i Kingston R. E. (1994). Facilitated binding of TATA-binding protein to nucleosomal DNA. Nature 370, 481-485

Izban M. G. i Luse D. S. (1992). Factor stimulated RNA polymerase II transcribes at physiological elongation rates on naked DNA, but very poorly on chromatin templates. J. Biol. Chem. 267, 13647-13655

Jeong S. W., Lauderdale J. D. i Stein A. (1991). Chromatin Assembly on Plasmid DNA in Vitro. J. Mol. Biol. 222, 1131-1147

Jerzmanowski A. i Cole R. D. (1990). Flanking Sequences of Xenopus 5S RNA Genes Determine Differential Inhibition of Transcription by H1 Histone in Vitro. J. Biol. Chem. 265, 10726-10732

Johnson A. D. (1995). The price of repression. Cell 81, 655-658

Kadonaga J. T. (1990). Assembly and Disassembly of the Drosophila RNA Polymerase II Complex during Transcription. J. Biol. Chem. 265, 2624-2631

Kamakaka R. T., Bulger M. i Kadonaga J. T. (1993). Potentiation of RNA polymerase II transcription by Gal4-VP16 during but not after DNA replication and chromatin assembly. Genes Dev. 7, 1779-1795

Kandolf H. (1994). The H1A histone variant is an in vivo repressor of oocyte-type 5S gene transcription in Xenopus laevis embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 7257-7261

Kä s E., Izaurralde E. i Laemmli U. K. (1989). Specific Inhibition of DNA Binding to Nuclear Scaffolds and Histone H1 by Distamycin. J. Mol. Biol. 210, 587-599

Keller W. (1975). Determination of the number of superhelical turns in simian virus 40 DNA by gel electrophoresis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 4876-4880

Kennison J. A i Tamkun J. W (1988). Dosage-dependent modifiers of Polycomb and Antennapedia mutations in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8136-8140

Khavari P. A., Peterson C. L., Tamkun J. W. i Crabtree G. R. (1993). BRG1 contains a conserved domain of the SWI2/SNF2 family necessary for normal mitotic growth and transcription. Nature 366, 170-174

Kingston R. E., Bunker C. A. i Imbalzano A. N. (1996). Repression and activation by multiprotein complexes that alter chromatin structure. Genes Dev. 10, 905-920

Kleinschmidt J. A. i Franke W. W. (1982). Soluble acidic complexes containing histones H3 and H4 in nuclei of Xenopus oocytes. Cell 29, 799-809

Kleinschmidt J. A., Dingwall C., Maier G. i Franke W. W. (1986). Molecular characterization of karyophilic, histone binding protein: cDNA cloning, amino acid sequence and expression of nuclear protein N1/N2 of Xenopus laevis. EMBO J. 5, 3547-3552

Kmiec E. B., Razvi F. i Worcel A. (1986). The role of DNA-mediated transfer of TFIIIA in the concerted gyration and differential activation of the Xenopus 5S RNA genes. Cell 45, 209-218

Korn L. J. i Brown D. D. (1978). Nucleotide Sequence of Xenopus borealis Oocyte 5S RNA: Composition of Sequence That Flank Several Eukaryotic Genes. Cell 15, 1145-56

Kornberg R. D. (1974). Chromatin Structure: A Repeating Unit of Histones and DNA. Science 184, 868-871

Krude T. i Elgin S. (1996). Pushing nucleosomes around. Current Biology 6, 511-515

Kruger W., Peterson C. L., Sil A., Coburn C., Arents G., Moudrianakis E. N. i Herskowitz I. (1995). Amino acids substitutions in the structured domains of histones H3 and H4 partially relieve the requirement of the yeast SWI/SNF complex for transcription. Genes Dev. 9, 2770-2779

Krylov D., Leuba S., van Holde K. i Zlatanova J. (1993). Histones H1 and H5 interact preferentially with crossovers of double-helical DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5052-5056

Kwon H., Imbalzano A. N., Khavari P. A., Kingston R. E. i Green M. R. (1994). Nucleosome disruption and enhancement of activator binding by a human SWI/SNF complex. Nature 370, 477-481

Laemmli U. K. (1970). Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature 227, 680-685

Laskey R. A., Mills A. D. i Morris N. R. (1977). Assembly of SV40 chromatin in a cell-free system from Xenopus eggs. Cell 10, 237-243

Laskey R. A ., Honda B. M., Mills A. D. i Finch J. T. (1978). Nucleosomes are assembled by an acidic protein which binds histones and transfers them to DNA. Nature 275, 416-20

Lauderdale J. D. i Stein A. (1992). Introns of the chicken ovalbumin gene promote nucleosome alignment in vitro. Nucl. Acids Research 20, 6589-6596

Lauderdale J. D. i Stein A. (1993). Effects of Plasmid Length and Positioned Nucleosomes on Chromatin Assembly in Vitro. Biochemistry 32, 489-499

Laurent B. C., Treich I. i Carlson M. (1993). The yeast SNF2/SWI2 protein has DNA-stimulated ATPase activity required for transcriptional activation. Genes Dev. 7, 583-591

Laybourn P. J. i Kadonaga J. T. (1991). Role of Nucleosomal Cores and Histone H1 in Regulation of Transcription by RNA Polymerase II. Science 254, 238-245

Lee D. Y., Hayes J. J., Pruss D. i Wolffe A. P. (1993). A positive role for histone acetylation in transcription factor binding to nucleosomal DNA. Cell 72, 73-84

Lee H. H. i Archer T. K. (1994). Nucleosome-mediated disruption of transcription factor-chromatin initiation complexes at the mouse mammary tumor virus long terminal repeat in vivo. Mol. Cell. Biol. 14, 32-41

Le Gouill C i Dery C. V. (1991). A rapid procedure for the screening of recombinant plasmids. Nucleic Acids Res. 19, 6655-6655

Leuther K. K. i Bushnell D. A. (1996). Two-dimensional crystallography of TFIIB- and IIE- RNA polymerase II complexes: Implications for start site selection and initiation complex formation. Cell 85, 773-779

Lewin B. (1997). Genes VI. Oxford University Press. Oxford 1997

Lis J. i Wu C. (1993). Protein traffic on the heat shock promoter: Parking, stalling and trucking along. Cell 74, 1-4

Liu K., Lauderdale J. D. i Stein A. (1993). Signals in chicken beta-globin DNA influence chromatin assembly in vitro. Mol. Cell. Biol. 13, 7596-7603

Liu K., Sandgren E. P., Palmiter R. D. i Stein A. (1995). Rat growth hormone gene introns stimulate nucleosome alignment in vitro and in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7724-7728

Lorch Y., LaPointe J. W i Kornberg R. D. (1987). Nucleosomes Inhibit the Initiation of Transcription but Allow Chain Elongation with the Displacement of Histones. Cell 49, 203-210

Lorch Y., LaPointe J. W. i Kornberg R. D. (1992). Initiation on chromatin templates in a yeast polymerase II transcription system. Genes Dev. 6, 2282-2287

Louters L. i Chalkley R. (1995). Exchange of histones H1, H2A and H2B in vivo. Biochemistry 24, 3080-3085

Lu Q., Wallrath L. L. i Elgin S. C. R. (1994). Nucleosome positioning and gene regulation. J. Cell. Biochem. 55, 83-92

Manley J. L., Fire A., Cano A., Sharp P. A. i Gefter M. L. (1980). DNA-dependent transcription of adenovirus genes in a soluble whole-cell extract. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 3855-3859

Manley J. L., Fire A., Samuels M. i Sharp P. A. (1983). In vitro transcription: whole-cell extract. Methods Enzymol. 101, 568-581

Mé chali M. i Harland R. M. (1982). DNA synthesis in a cell free system from Xenopus eggs: priming and elongation on single stranded DNA in vitro. Cell 30, 93-101

Meersseman G., Pennings S. i Bradbury E. M. (1991). Chromatosome Positioning on Assembled Long Chromatin: Linker Histones Affect Nucleosome Placement on 5S rDNA. J. Mol. Biol. 220, 89-100

Mizzen C. A., Yang X. J., Kokubo T., Brownell J. E., Bannister A. J., Owen-Hughes T., Workman J., Wang L., Berger S. L., Kouzarides T., Nakatani Y. i Allis C. D. (1996). The TAF(II)250 subunit of TFIID has histone acetyltransferase activity. Cell 87, 1261-1270

Moretti P., Freeman K., Coodly L. i Shore D. (1994). Evidence that a complex of SIR proteins interacts with the silencer and telomere-binding protein RAP1. Genes Dev. 8, 2257-2269

Morse R. H. (1986). Nucleosomes inhibit both transcriptional initiation and elongation by RNA polymerase in vitro. EMBO J. 8, 2343-2351

Muchardt C. i Yaniv M. (1993). A human homologue of Saccharomyces cerevisiae SNF2/SWI2 and Drosophila brm genes potentiates transcriptional activation by the glucocorticoid receptor. EMBO J. 12, 4279-4290

Nakanishi Y., Maeda K., Ohtsuki M., Hosokawa K. i Natori S. (1986). In vitro transcription of a chromatin-like complex of major core protein VII and DNA of adenovirus serotype 2. Biochem. Biophys. Res. Commun. 136, 86-93

Nedospasov A. A., Shakhow A. N. i Georgiev G. P. (1989). Analysis of Nucleosome Positioning by Indirect End-Labeling and Molecular Cloning. W: Methods Enzymol. 170, 408-420 (Wassarman P. M., Kornberg R. D., eds.) Academic Press

Neigeborn L. i Carlson M. (1984). Genes affacting the regulation of SUC2 gene expression by glucose repression in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 108, 845-858

Newlon C. S. (1993). Two jobs for the origin replication complex. Science 262,1830-1831

Okabe I., Bailey L. C., Attree O., Srinivasan S., Perkel J. M., Laurent B. C., Carlson M., Nelson D. L. i Nussbaum R. L. (1992). Cloning of human and bovine homologs of SNF2/SWI2 a global activator of transcription in yeast S. cerevisiae. Nucleic Acids Res. 20, 4649-4655

O’Donohue M. F., Duband-Goulet I., Hamiche A. i Prunell A. (1994). Octamer displacement and redistribution in transcription of single nucleosomes. Nucleic Acids Res. 22, 937-945

O’Neill T. E., Roberge M. i Bradbury E. M. (1992). Nucleosome Arrays Inhibit Both Initiation and Elongation of Transcripts by Bacteriophage T7 RNA Polymerase. J. Mol. Biol. 223, 67-78

O’Neill T. E., Meersseman G., Pennings S. i Bradbury E. M. (1995). Deposition of histone H1 onto reconstituted nucleosome arrays inhibits both initiation and elongation of transcripts by T7 RNA polymerase. Nucleic Acids Res. 23, 1075-1082

Oudet P., Gross-Bellard M i Chambon P. (1975). Electron Microscopic and Biochemical Evidence that Chromatin Structure Is a Repeating Unit. Cell 4, 281-300

Pahlvani M. A. i wsp. (1995). The expression of heat shock protein 70 decrease with age in lymphocytes from rats and rhesus monkeys. Exp. Cell Res. 218, 310-318

Palladino F. i Gasser S. M. (1994). Telomere maintenance and gene repression: A common end? Curr. Opin. Cell Biol. 6, 373-379

Paro R. i Hogness D. S. (1991). The Polycomb protein shares a homologous domain with a heterochromatin-associated protein of Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 263-67

Pazin M. J., Kamakaka R. T. i Kadonaga J. T. (1994). ATP-Dependent Nucleosome Reconfiguration and Transcriptional Activation from Preassembled Chromatin Templates. Science 266, 2007-2011

Peterson L. i Herskowitz i. (1992). Characterization of the yeast SWI1, SWI2 and SWI3 genes, which encode a global activator of transcription. Cell 68, 573-583

Peterson R. C., Doering J. L. i Brown D. D. (1980). Characterization of Two Xenopus Somatic 5S DNAs and One Minor Oocyte-Specific 5S DNA. Cell 20, 131-141

Pfaffle P. i Jackson V. (1990). Studies on Rates of Nucleosome Formation with DNA under Stress. J. Biol. Chem. 265, 16821-16829

Pruss D., Bartholomew B., Presinger L., Hayes L., Arents G., Moudrianakis E. N. i Wolffe A. P. (1996). An asymmetric model for the nucleosome: a binding site for linker histones inside the DNA gyres. Science 274, 614-617

Prymakowska-Bosak M., Przewłoka M. R., Iwkiewicz J., Egierszdorff S., Kuraś M., Chaubet N., Gigot C., Spiker S. i Jerzmanowski A. (1996). Histone H1 overexpressed to high level in tobacco affects certain developmental programs but has limited effect on basal cellular functions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 10250-10255

Prymakowska-Bosak M. i Tomaszewski R. (1996). Izolowanie DNA z żelu agarozowego. W: Skrypt do ćwiczeń Biologia Molekularna Roślin. Uniwersytet Warszawski, IBB PAN, 6-9. Warszawa

Quinn J., Fyrberg A. M., Ganster R. W., Schmidt M. C. i Peterson C. L. (1996). The yeast SWI/SNF complex has DNA-binding properties similar to HMG-box proteins. Nature 379, 844-847

Ramakrishnan V., Finch J. T., Graziano V., Lee P. L. i Sweet R. M. (1993). Crystal structure of globular domain of histone H5 and its implications for nucleosome binding. Nature 362, 219-224

Rastelli L., Chan C. S. i Pirrotta V. (1993). Related chromosome binding sites for zeste, suppressors of zeste and Polycomb group proteins in Drosophila and their dependence on Enhancer of zeste function. EMBO J. 12, 1513-1522

Richard-Foy H. i Hager G. L. (1987). Sequence-specific positioning of nucleosomes over the steroid-inducible MMTV promoter. EMBO J. 6, 2321-2328

Richardson C. C. (1971). Polynucleotide kinase from Escherichia coli infected with bacteriophage T4. W: Procedures in nucleic acid research 2, 815 (Cantoni G. L., Davies D. R., eds) Harper and Row, New York

Rodriguez-Campos A., Shimamura A. i Worcel A. (1989). Assembly and Properties of Chromatin Containing Histone H1. J. Mol. Biol. 209, 135-150

Rodriguez-Campos A. (1996). DNA knotting abolishes in vitro chromatin assembly. J. Biol. Chem. 271, 14150-14155

Roeder R. G. (1996). The role of general initiation factors in transcription by RNA polymerase II. Trends Bioch. Sci. 21, 327-335

Rosenberg U. B., Schroder C., Preiss A., Kienlin A., Cote S., Riede I. i Jackle H. (1986). Structural homology of the product of the Drosophila Kruppel gene with Xenopus transcription factor IIIA. Nature 319, 336-338

Roth S. Y., Dean A. i Simpson R. T. (1990). Yeast a 2 repressor positions nucleosomes in TRP1/ARS1 chromatin. Mol. Cell. Biol. 10, 2247-2260

Roth S. Y. (1995). Chromatin-mediated transcriptional repression in yeast. Curr. Opin. Genet. Dev. 5, 168-173

Sambrook J., Fritsch E. F. i Maniatis T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.

Schild C., Claret F. X., Wahli W. i Wolffe A. P. (1993). A nucleosome-dependent static loop potentiates estrogen-regulated transcription from the Xenopus vitellogenin B1 promoter in vitro. EMBO J. 12, 423-433

Schlissel M. S. i Brown D. D. (1984). The Transcriptional Regulation of Xenopus 5S RNA Genes in Chromatin: The Roles of Active Stable Transcription Complexes and Histone H1. Cell 37, 903-913

Sekiguchi J. A. i Kmiec E. B. (1988). Studies on DNA topoisomerase activity during in vitro chromatin assembly. Mol. Cell. Biochem. 83, 195-205

Shapiro D. J., Sharp P. A., Wahli W. W. i Keller M. J. (1988). A High-Efficiency HeLa Cell Nuclear Transcription Extract. DNA 7, 47-55

Shen X., Yu L., Weir J. W. i Gorovsky M. A. (1995). Linker histones are not essential and affect chromatin condensation in vivo. Cell 82, 47-56

Shen X. i Gorovsky M. A. (1996). Linker histone H1 regulates specific gene expression but not global transcription in vivo. Cell 86, 475-883

Shimamura A. i Worcel A. (1989). The assembly of regularly spaced nucleosomes in the Xenopus S150 extract is accompanied by deacetylation of histone H4. J. Biol. Chem. 264, 14524-14530

Shimamura A., Sapp M., Rodriguez-Campos A. i Worcel A. (1989). Histone H1 represses transcription from minichromosomes assembled in vitro. Mol. Cell. Biol. 9, 5573-5584

Shimizu M., Roth S. Y., Szent-Gyorgyi C. i Simpson R. T. (1991). Nucleosomes are positioned with base pair precision adjacent to the a 2 operator in Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 10, 3033-3041

Simon J. (1995). Locking in stable states of gene expression: transcriptional control during Drosophila development. Curr. Opin. Cell Biol. 7, 376-385

Simpson R. T. (1978). Structure of the chromatosome, a chromatin particle containing 160 base pairs of DNA and all the histones. Biochemistry 17, 5524-5531

Simpson R. T. (1991). Nucleosome positioning: Occurence, mechanisms, and functional consequences. Prog. Nucleic Acids Res. Mol. Biol. 40, 143-184

Simpson R. T., Thoma F. i Brubaker J. M. (1985). Chromatin Reconstituted from Tandemly Repeated Cloned DNA Fragments and Core Histones: A Model System for Study of Higher Order Structure. Cell 42, 799-808

Smith R. C., Dworkon-Rastl E. i Dworkon M. B. (1988). Expression of histone H1-like protein id restricted to early Xenopus development. Genes Dev. 2, 1284-1295

Sobczyńska A. (1997). Opracowanie metody transkrypcji in vitro i jej zastosowanie do badania ekspresji genów. Praca magisterska, Pracownia Biologii Molekularnej Roślin UW, 30-34. Warszawa

Southern E. M. (1975). Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 98, 503-517

Spencer T. E., Jenster G., Burcin M. M., Allis C. D., Zhou J., Mizzen C. A., McKenna N. J., Onate S.A., Tsai S. Y., Tsai M. J. i O'Malley B. W. (1997). Steroid receptor coactivator-1 is a histone acetyltransferase. Nature 389, 194-198

Stein A. (1979). DNA Folding by Histones: The Kinetics of Chromatin Core Particle Reassembly and the Interaction of Nucleosomes with Histones. J. Mol. Biol. 130, 103-34

Stein A. (1989). Reconstitution of Chromatin from Purified Components. W: Methods Enzymol. 170, 583-603 (Wassarman P. M., Kornberg R. D., eds.) Academic Press

Stein A. (1996). Signals in Eukaryotic DNA Promote and Influence Formation of Nucleosome Arrays. Prog. Nucl. Acid Res. Mol. Biol. 54, 333-377

Stein A. i Bina M. (1984). A Model Chromatin Assembly System: Factors Affecting Nucleosome Spacing. J. Mol. Bio. 178, 341-363

Stern M. J., Jensen J. i Herskowitz I. (1984). Five SWI genes are required for expression of the HO gene in yeast. J. Mol. Biol. 178, 853-868

Sternberg P. W., Stern M. J., Clark I. i Herskowitz I. (1987). Activation of the yeast HO gene by release from multiple negative controls. Cell 48, 567-577

Storm R., Santoro R., D’Erme M., Mastrantonio S., Reale A., Marenzi S., Zardo G. i Caiafa P. (1995). Specific variants of H1 histone regulate CpG methylation in eukaryotic DNA. Gene 157, 253-256

Studitsky V. M., Clark D. J. i Felsenfeld G. (1994). A Histone Octamer Can Step around a Transcribing Polymerase without Leaving the Template. Cell 76, 371-382

Studitsky V. M., Clark D. J. i Felsenfeld G. (1995). Overcoming a Nucleosomal Barrier to Transcription. Cell 83, 19-27

Svaren J. i Chalkley R. (1990). The structure and assembly of active chromatin. Trends Genet. 6, 52-56

Svejstrup J. Q. (1996). The multiple roles of transcription/repair factor TFIIH. Trends Bioch. Sci. 21, 346-350

Tamkun J. W., Deuring M. P., Scott M. P., Kissinger M. Pattatucci A. M., Kaufman T. C. i Kennison J. A. (1992). Brahma: a regulator of Drosophila homeotic genes structurally related to the yeast transcription activator SNF2/SWI2. Cell 68, 561-572

Tan S., Hunziker Y., Sargent D. F. i Richmond T. J. (1996). Crystal structure of a yeast TFIIA/TBP/DNA complex. Nature 381, 127-134

Taylor I. C. A., Workman J. L., Schuetz T. J. i Kingston R. E. (1991). Facilitated binding of GAL4 and heat shock factor to nucleosomal templates: differential function of DNA-binding domains. Genes Dev. 5, 1285-1298

Thoma F. (1992). Nucleosome positioning. Biochim. Biophys. Acta 1130, 1-19

Timmermans M. C. P., Maliga P., Vivera J. i Messig I. (1990). The pFF plasmid: cassetes utilising CaMV sequences for expression of foreign genes in plants. J. Biotech. 14, 333-344

Tomaszewski R. (1995). Rekonstytucja chromatyny z czystych składników in vitro. W: Inżynieria Genetyczna i Biologia Molekularna. Metody. Podręcznik laboratoryjny IBB PAN, 5.5-5.7. Warszawa

Tomaszewski R. i Jerzmanowski A. (1997). The AT-rich flanks of the oocyte-type 5S RNA gene of Xenopus laevis act as a strong local signal for histone H1-mediated chromatin reorganization in vitro. Nucleic Acids Res. 25, 458-465

Tsukiyama T., Becker P. B. i Wu C. (1994). ATP-dependent nucleosome disruption at a heat shock promoter mediated by binding of GAGA transcription factor. Nature 367, 525-532

Tsukiyama T. i Wu C. (1995). Purification and properties of an ATP-dependent nucleosome remodeling factor. Cell 83, 1011-1020

Tsukiyama T., Daniel C., Tamkun J. i Wu C. (1995). ISWI, a member of the SWI2/SNF2 ATPase family, encode the 140 kDa subunit of the nucleosome remodeling factor. Cell 83, 1021-1026

Turner B. M. (1991). Histone acetylation and control of gene expression. J. Cell. Sci 99, 13-20

Ura K., Wolffe A. P. i Hayes J. J. (1994). Core Histone Acetylation Does Not Block Linker Histone Binding to a Nucleosome Including a Xenopus borealis 5S rRNA Gene. J. Biol. Chem. 269, 27171-27174

Ura K., Hayes J. J. i Wolffe A. P. (1995). A positive role for nucleosome mobility in the transcriptional activity of chromatin templates: restriction by linker histones. EMBO J. 14, 3752-3765

van Holde K. E. (1989). Chromatin. Springer-Verlag. New York

van Holde K. E., Lohr D. E. i Robert C. (1992). What Happens to Nucleosomes during Transcription? J. Biol. Chem. 267, 2837-2840

van Lohuizen M., Frasch M., Wientjens E. i Berns A. (1991). Sequence similarity between the mammalian bmi-1 protooncogene and the Drosophila regulatory genes Psc and Su(z)2. Nature 353, 353-355

Varga-Weisz P. D., Blank T. A. i Becker P. B. (1995). Energy-dependent chromatin accessibility and nucleosome mobility in a cell-free system. EMBO J. 14, 2209-2216

Vettesse-Dadey M., Walter P., Chen H., Juan L. i Workman J. L. (1994). Role of the histone amino termini in facilitated binding of a transcription factor, GAL4-AH to nucleosome cores. Mol. Cell. Biol. 14, 970-981

von Holt C., Brandt W. F., Greyling H. J., Lindsey G. G., Retief J. D., Rodrigues J. de A., Schwager S. i Sewell B. T. (1989). Histones: Preparation and Analysis. W: Methods Enzymol. 170, 434-451 (Wassarman P. M., Kornberg R. D., eds.) Academic Press

Wall G., Varga-Weisz P. D., Sandaltzopoulos R. i Becker P. B. (1995). Chromatin remodeling by GAGA factor and heat shock factor at the Drosophila hsp26 promoter in vitro. EMBO J. 14, 1727-1736

Varga-Weisz P. D., Blank T. A. i Becker P. B. (1995). Energy-dependent chromatin accessibility and nucleosome mobility in a cell-free system. EMBO J. 14, 2209-2216

Wang L., Mizzen C., Ying C., Candau R., Barlev N., Brownell J., Allis C. D. i Berger S. L. (1997). Histone acetyltransferase activity is conserved between yeast and human GCN5 and is required for complementation of growth and transcriptional activation. Mol. Cell. Biol. 17, 519-527

Weintraub H. (1984). Histone-H1-Dependent Chromatin Superstructures and the Supression of Gene Activity. Cell 38, 17-27

Winston F. i Carlson M. (1992). Yeast SNF/SWI transcriptional activators and the SPT/SIN chromatin connection. Trends Genet. 8, 387-391

Wolffe A. P. (1991). Implications of DNA replication for eukaryotic gene expression. J. Cell. Sci. 99, 201-206

Wolffe A. P. (1992). Chromatin. Structure and Function, 88-96. Academic Press. London

Wolffe A. P. i Dimitrov S. (1993). Histone modulated gene activity: developmental implications. Crit. Rev. Euk. Gene Exp. 3, 167-191

Wolffe A. P. (1994a). Nucleosome positioning and modification: chromatin structure that potentiate transcription. Trends Biochem Sci 19, 240-244

Wolffe A. P. (1994b). Regulation of Chromatin Structure and Function. R. G. Landes Company. Austin

Workman J. L. i Buchman A. R. (1993). Multiple functions of nucleosomes and regulatory factors in transcription. Trends Biochem. Sci 18, 90-95

Workman J. L. i Roeder R. G. (1987). Binding of transcription factor TFIID to the major late promoter during in vitro mucleosome assembly potentiates subsequent initiation by RNA polymerase II. Cell 51, 613-622

Wormington W. M., Schlissel M. i Brown D. D. (1982). Developmental regulation of Xenopus 5S RNA genes. Cold Sprinh Harbor Symp. quant. Biol. 47, 879-884

Zaret K. S. i Yamamoto K. R. (1984). Reversible and persistent changes in chromatin structure accompany activation of a glucocortycoid dependent enhancer element. Cell 38, 29-38

Zivanovic Y., Duband-Goulet I., Schultz P., Stofer E., Oudet P. i Prunell A. (1990). Chromatin Reconstitution on Small DNA Rings. III. Histone H5 Dependence of DNA Supercoiling in the Nucleosome. J. Biol. Chem. 214, 479-495
 
 



Š Copyright 1998 Piotr Kozbial,  All rights reserved.