Opracowano szereg metod oczyszczania plazmidowego DNA, z których każda obejmuje trzy etapy:
- hodowlę bakterii (i ewentualnie amplifikację plazmidu),
- lizę bakterii,
- oczyszczanie plazmidowego DNA.
Plazmidy izoluje się najczęściej z hodowli płynnych, w których podłoże uzupełnione jest odpowiednim antybiotykiem. Wysokokopijne wektory plazmidowe (np. serii pUC), otrzymywane są z hodowli znajdującej się w póYnej fazie logarytmicznej wzrostu, podczas gdy wektory nisko- i średniokopijne (np. pBR322) powinny być przed izolacją amplifikowane. Do częściowo wyrośniętej hodowli dodaje się w tym celu chloramfenikol, który selektywnie zapobiega replikacji chromosomu bakteryjnego.
We wszystkich metodach izolacji plazmidowego DNA wykorzystuje się dwie istotne różnice pomiędzy DNA genomowym a DNA plazmidowym bakterii:
- DNA genomowy jest wielokrotnie większy od DNA plazmidu,
- podczas procedury izolacji DNA plazmidowego DNA genomowy zostaje trwale zniszczony, podczas gdy DNA plazmidowy pozostaje w postaci form CCC (ang. covalently closed circle).
Odwirowane komórki bakteryjne poddawane są lizie. Bakterie ulegają lizie pod wpływem niejonowych lub jonowych detergentów (SDS, Sarkozyl, Triton X-100), rozpuszczalników organicznych, roztworów alkalicznych (liza alkaliczna) lub wysokiej temperatury (liza termiczna). Stosowany może być również lizozym - enzym trawiący ścianę komórkową bakterii (nie działa w pH<8.0). W metodzie lizy alkalicznej bufor o wysokim pH zawierający NaOH i SDS powoduje całkowitą lizę komórki jak również denaturację genomowego DNA, natomiast plazmidowy DNA w formie CCC zostaje zdenaturowany jedynie na niewielkich odcinkach. W przypadku otrzymywania plazmidowego DNA metodą termiczną, czynnikiem denaturującym jest wysoka temperatura, w której DNA genomowy i plazmidowy zachowują się podobnie jak w wysokim pH.
Następny etap oczyszczania DNA polega na oddzieleniu DNA od związanych z nim białek. Zwykle stosuje się do tego celu nasycony buforem roztwór fenolu lub jego mieszaninę z chloroformem i alkoholem izoamylowym. Białka można również usunąć przez trawienie ich proteinazami (zwykle proteinazą K). Usunięcie kwasu RNA przeprowadza się enzymatycznie, inkubując próbki z RNazą (wolną od DNazy), przez sączenie molekularne lub wirowanie w gradiencie gęstości (patrz, dalej). W metodzie lizy alkalicznej, kiedy liniowe cząsteczki DNA ulegają denaturacji, natomiast superzwinięte formy CCC plazmidu są po denaturacji nadal splecione, neutralizacja pH roztworami o wysokim stężeniu soli (np. octan amonu) prowadzi do renaturacji jedynie DNA plazmidowego, podczas gdy DNA genomowy wraz z RNA i białkami wytrąca się w postaci serowatego osadu.
Z odbiałczonych próbek DNA wytrącany jest alkoholem etylowym lub izopropanolem w obecności octanu potasowego, sodowego lub amonowego.
Wszystkie metody otrzymywania plazmidowego DNA, z wyjątkiem lizy alkalicznej, wymagają oddzielenia tego DNA od DNA genomowego w gradiencie chlorku cezu w obecności bromku etydyny. Wykorzystuje się tu fakt, że bromek etydyny intensywniej interkaluje do zdenaturowanego DNA genomowego niż do DNA plazmidowego, powodując częściowe rozwinięcie helisy DNA i wydłużenie cząsteczki, co powoduje zmniejszenie jej gęstości pławnej. Różnica w gęstości pomiędzy formą CCC a liniową i kolistą OC (ang. open circle) wynosi około 0.04 g/ml i jest wystarczająca do oddzielenia superzwiniętego DNA podczas wirowania w gradiencie gęstości chlorku cezu w obecności bromku etydyny. Pasmo superzwiniętego DNA układa się poniżej pasma utworzonego przez liniowe fragmenty chromosomowego DNA oraz formy liniowej i OC plazmidu. Cząsteczki RNA mają największą gęstość i zbierają się na dnie probówki wirowniczej, zaś białka pozostają w górnej warstwie roztworu.
Oczyszczanie plazmidowego DNA przeprowadzić można również metodą wirowania lizatów komórkowych w gradiencie alkalicznej sacharozy (w środowisku alkalicznym formy liniowe i OC ulegają rozdzieleniu na pojedyncze nici i sedymentują 3-4 razy wolniej niż niezdenaturowana superzwinięta forma CCC), stosując wymieniacze jonowe (np. kolumienki Qiagen) lub filtrację na żelach.
Otrzymywanie DNA plazmidowego na małą skalę (minilizaty)
Odczynniki i aparatura:
- pożywka LBamp płynna
- pożywka LBamp stała
- RNaza (10 mg/ml)
- roztwór I: 25 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM glukoza, 10 mM EDTA
- roztwór II: 0.2 M NaOH, 1 % SDS (przygotować tuż przed użyciem)
- roztwór III: 7.5 M octan amonu
- etanol 96 %
- etanol 70 %
- bufor TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA)
- agaroza,
- bromek etydyny (10 mg/ml),
- bufor TBE (45 mM Tris-boran, 1 mM EDTA),
- barwnik do elektroforezy,
- probówki szklane (10 ml),
- probówki Eppendorfa,
- mikrowirówka,
- SpeedVac,
- aparat do elektroforezy.
Wykonanie:
- poprzedniego dnia, bakterie z wybranych kolonii bakteryjnych zaszczepić do 3 ml pożywki płynnej LBamp. Hodować przez noc w 37oC, z wytrząsaniem,
- rozlać hodowle bakteryjną do probówek Eppendorfa i zwirować bakterie w mikrowirówce przez 1 minutę (2 x 1.5 ml),
- odsączyć pipetą pożywkę do sucha,
- zawiesić osad końcówką do pipety w 100 ul roztworu I, dodać 5 ul RNazy,
- inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej,
- do probówki Eppendorfa dodać 200 ul świeżo przygotowanego roztworu II,
- zamieszać BARDZO delikatnie i wstawić do lodu na 5 minut,
- dodać 150 ul zimnego (z lodówki) roztworu III, dwukrotnie BARDZO SILNIE wstrząsnąć i wstawić do lodu na 10 minut,
- zwirować 15 minut,
- zebrać klarowny supernatant (można zwirować go powtórnie),
- dodać 900 ul etanolu 96 % i inkubować co najmniej 20 minut w temperaturze -20oC,
- zwirować 15-20 minut w mikrowirówce,
- zlać etanol, osad przemyć 1 ml etanolu 70 %, zwirować,
- wysuszyć na SpeedVacu (do 5 minut),
- osad zawiesić w 50 ul buforu TE
- przygotować 0.8 % żel agarozowy w buforze TBE (dodać bromku etydyny do stężenia 0.5 ug/ml) ,
- nanieść na żel 5 ul preparatu z 1 ul barwnika do elektroforezy,
- prowadzić elektroforezę w buforze TBE przy napięciu nie przekraczającym 5 V/cm,
- sfotografować żel na transiluminatorze w świetle UV (ocenić jakość i ilość DNA w preparacie.
Bardzo szybka metoda otrzymywania DNA plazmidowego bakterii
Odczynniki i aparatura:
- pożywka LBamp stała,
- roztwór I: 9 objętości barwnika do elektroforezy + 11 objętości wody + 40 objętości mieszaniny 0.2 M NaOH i 1 % SDS (przygotować tuż przed użyciem),
- roztwór II: 3 M octan potasu, 1.8 M kwas mrówkowy,
- agaroza,
- bufor TBE (45 mM Tris-boran, 1 mM EDTA),
- bromek etydyny (10 mg/ml),
- barwnik do elektroforezy,
- probówki Eppendorfa,
- mikrowirówka,
- aparat do elektroforezy.
Wykonanie:
- wybrane kolonie przeszczepić na szalkę LBamp. Hodować przez noc w 37oC,
- odpipetować do probówek Eppendorfa po 16 ul roztworu I,
- zebrać końcówką do pipety połowę kolonii i zawiesić w przygotowanym roztworzeI,
- dodać 3 ul roztworu II,
- zwirować 5 minut w mikrowirówce,
- supernatant nanieść bezpośrednio na 0.8 % żel agarozowy (bufor TBE, bromek etydyny w żelu: stężenie końcowe 0.5 ug/ml),
- prowadzić elektroforezę w buforze TBE przy napięciu nie przekraczającym 5 V/cm,
- sfotografować żel na transiluminatorze w świetle UV.
Uwaga! Bromku etydyny należy dodawać w rękawiczkach !
Uwaga! Należy przestrzegać zasad pracy z transiluminatorem !