Enzymy restrykcyjne (ang. restriction enzymes) są enzymami izolowanymi z bakterii, zdolnymi do rozpoznawania specyficznych sekwencji w DNA i przecinania dwuniciowej cząsteczki DNA. Enzymy restrykcyjne typu II wymagają jako substratu dwuniciowej cząsteczki DNA, zawierającej co najmniej jedną sekwencję rozpoznawaną przez dany enzym, oraz jonów magnezu. DNA zostaje przecięte w obrębie lub w okolicy sekwencji rozpoznawanej.
Większość enzymów restrykcyjnych typu II rozpoznaje palindromowe (posiadające oś symetrii) sekwencje cztero- lub sześcionukleotydowe (tzw. enzymy czwórkowe lub szóstkowe). Nacięcia w obu niciach mogą leżeć naprzeciwko siebie i wówczas powstają tzw. "tępe końce", np. enzym HaeIII z Haemophilus aegypticus rozpoznaje i przecina następującą sekwencję:
5' GGCC 3'
3' CCGG 5'
w wyniku czego powstają "tępe końce":
5' GG i CC 3'
3' CC i GG 5'
Z kolei enzym EcoRI ze szczepu E.coli RY13 rozpoznaje sześcionukleotydową sekwencję:
5' GAATTC 3'
3' CTTAAG 5'
przecinając obie nici DNA tak, że powstają tzw. "lepkie końce" w postaci jednoniciowych czteronukleotydowych końców 5':
5' G i AATTC 3'
3' CTTAA G 5'
Niektóre enzymy produkują "lepkie końce" 3'. Wszystkie natomiast pozostawiają grupę fosforanową na końcu 5', a grupę hydrokylową na końcu 3'.
"Lepkie końce" mają duże znaczenie przy klonowaniu genów: sekwencje "lepkich końców" powstałych w wyniku działania tego samego enzymu są komplementarne. W obecności enzymu ligazy można takie cząsteczki ponownie połączyć ze sobą kowalencyjnie.
Nazewnictwo enzymów restrykcyjnych opiera się na literowych skrótach, w których pierwsza litera pochodzi od rodzaju bakterii, a druga i trzecia od gatunku. Następna litera oznacza szczep lub typ, a kolejne enzymy z danego typu lub szczepu otrzymują liczby rzymskie.
Enzymy pochodzące z różnych szczepów, ale rozpoznające te same sekwencje DNA, nazywają się izoschizomerami.
Zdarza się, że dwa enzymy wytwarzają takie same "lepkie końce", mino że rozpoznają różne sekwencje DNA. Enzym BamHI produkuje końce GATCC (rozpoznaje sekwencję GGATCC), zaś enzym BglII, wytwarzający takie same "lepkie końce", rozpoznaje sekwencję AGATCT. Umożliwia to klonowanie DNA strawionego BamHI w wektorze strawionym BglII, ale nie każdy sklonowany odcinek DNA będzie mógł być wycinany enzymem BglII.
Do pojedynczej reakcji trawienia używa się zwykle 0.2 - 1 ug DNA w roztworze o objętości 20 ul lub mniejszej. Bufory do trawień przygotowuje się w postaci 10-krotnie stężonych roztworów różniących się między sobą zawartością soli. Jeżeli DNA ma być strawiony dwoma enzymami wymagającymi różnych buforów, najpierw przeprowadza się trawienie w buforze o niższej soli, a następnie podwyższa się stężenie soli w mieszaninie przez dodanie odpowiedniej objętości stężonego NaCl.
Inkubację preparatów DNA z enzymami restrykcyjnymi prowadzi się w temperaturze 37oC w czasie 1 godziny lub dłużej. Przerwanie reakcji (zwykle niekonieczne) można przeprowadzić przez termiczną inaktywację enzymu (15 minut, 65oC) lub dodając EDTA pH 8.0 do końcowego stężenia 10 mM (chelatacja jonów magnezu).
Źródłem informacji o enzymach restrykcyjnych (ich termostabilności i wymaganiach co do stężenia soli) są katalogi firm produkujących te enzymy (np. New England Biolabs, Promega).
Jednostka enzymu restrykcyjnego to taka jego ilość, która trawi kompletnie 1 ug DNA faga l (ok. 50 kb) w czasie 1 godziny w 37oC.
Podstawową cechą produktów trawienia DNA enzymami restrykcyjnymi jest to, że otrzymywane fragmenty DNA dają się rozdzielić na żelach w taki sposób, że w każdym prążku na żelu znajdują się cząsteczki DNA o identycznej sekwencji nukleotydowej. Fakt ten pozwala na precyzyjną obróbkę DNA, m.in. konstruowanie map restrykcyjnych badanego DNA (mapa restrykcyjna wskazuje miejsca cięte przez enzymy restrykcyjne). Analizując na żelach produkty trawienia danego DNA różnymi enzymami restrykcyjnymi, stosowanymi pojedynczo i w kombinacjach, można ustalić wzajemne położenie i odległości pomiędzy sekwencjami rozpoznawanymi przez te enzymy. Oprócz tego, DNA pocięty enzymami restrykcyjnymi można poddawać ligacji z wektorem i tworzyć zrekombinowane (zawierające sklonowany DNA) plazmidy.
Sporządzanie mapy restrykcyjnej plazmidu poprzedzone jest kalibracją żelu. Przeprowadza się ją w oparciu o zasadę, że droga migracji liniowej cząsteczki DNA w żelu agarozowym jest odwrotnie proporcjonalna do logarytmu dziesiętnego jej masy cząsteczkowej. Aby wyznaczyć wielkość nieznanych fragmentów DNA, stosuje się standardy wielkości (cząsteczki DNA o znanej wielkości, poddawane elektroforezie w tym samym żelu co cząsteczki badane).
Trawienie plazmidu atts 2257 enzymami restrykcyjnymi. Sporządzanie mapy restrykcyjnej
Odczynniki i aparatura:
- plazmid atts 2257 (4.82 kb) o stężeniu ok. 1 mg/ml,
- standard wielkości DNA,
- enzymy Xho I, HindIII, PstI,
- bufory do trawień,
- agaroza,
- bromek etydyny (10 mg/ml),
- bufor TBE (45 mM Tris-boran, 1 mM EDTA),
- barwnik do elektroforezy,
- probówki Eppendorfa,
- mikrowirówka,
- łaYnia wodna na 37oC,
- aparat do elektroforezy.
Wykonanie:
- strawić DNA plazmidowy enzymami Xho I, HindIII, PstI pojedynczo i w kombinacjach,
- przygotować 0.8 % żel agarozowy w buforze TBE (dodać bromku etydyny do żelu do stężenia 0.5 ug/ml lub do próbek bezpośrednio przed naniesieniem na żel),
- do strawionych próbek oraz do markera wielkości DNA dodać 1/10 objętości barwnika do elektroforezy,
- nanieść próbki na żel przy pomocy pipety automatycznej (Uwaga! Minimalna ilość DNA, którą widać na żelu w postaci prążka, wynosi około 10 ng. Nie należy przekraczać 200 ng DNA w prążku),
- prowadzić elektroforezę w buforze TBE przy napięciu nie przekraczającym 5 V/cm,
- sfotografować żel na transiluminatorze w świetle UV,
- wykreślić na papierze półlogarytmicznym krzywą kalibracyjną żelu,
- oszacować na podstawie krzywej wielkości trawionych fragmentów DNA i narysować mapę restrykcyjną plazmidu.
Uwaga! Bromku etydyny należy dodawać w rękawiczkach !
Uwaga! Należy przestrzegać zasad pracy z transiluminatorem !