Technika PCR (ang. polymerase chain reaction), opracowana w latach 80-ych, zrewolucjonizowała genetykę molekularną, umożliwiając otrzymywanie dużej liczby kopii unikalnych fragmentów DNA bez konieczności stosowania żmudnych i długotrwałych procedur klonowania.
Metoda PCR oparta jest na replikacji DNA in vitro: polimeraza DNA, wykorzystując jednoniciowe DNA (ang. single-stranded DNA, ssDNA) jako matrycę do syntezy nici komplementarnej, wymaga również krótkich fragmentów dwuniciowych, aby zapoczątkować syntezę nowej nici w kierunku 5' - 3'. W praktyce laboratoryjnej jednoniciowe DNA uzyskuje się ogrzewając DNA dwuniciowe (ang. double-stranded DNA, dsDNA) do temperatury bliskiej 100oC, zaś jako startery służą dodawane oligonukleotydy (tzw. primery) wiążące się specyficznie (hybrydyzujące) z określonym miejscem na jednoniciowej matrycy. Oligonukleotydy (primery) hybrydyzują z miejscami na obydwu niciach. Dobiera się je tak, aby oskrzydlały odcinek DNA, który ma być zreplikowany.
Replikacja rozpoczyna się od primerów na każdej nici i zachodzi na obu niciach w dwóch przeciwstawnych kierunkach. Na nowosyntetyzowanych niciach powstają zatem nowe miejsca wiązania primerów. Po zakończeniu replikacji nici są rozdzielane (denaturacja), aby ponownie umożliwić wiązanie znajdujących się w nadmiarze primerów (tzw. annealing), syntezę DNA i kolejne rozdzielenie nici. Cykl taki powtarza się wielokrotnie, a po n cyklach otrzymuje się teoretycznie 2n dwuniciowych cząsteczek DNA będących kopiami sekwencji zawartej pomiędzy primerami.
Typowy schemat reakcji PCR jest więc szeregiem cykli złożonych z następujących etapów: 1) denaturacji DNA (2-5' 90-95oC), 2) hybrydyzacji (annealingu) primerów (1-2' 40-60oC), 3) elongacji (syntezy DNA)(1-3' 70-75oC). W każdym cyklu liczba cząsteczek syntetyzowanego DNA jest podwajana. Efektem replikacji DNA techniką PCR jest więc amplifikacja specyficznego obszaru DNA.
Amplifikacja DNA metodą PCR znajduje szereg zastosowań w diagnostyce i terapii, m.in. do mapowania mutacji, monitorowania leczenia nowotworów, wykrywania infekcji bakteryjnych i wirusowych, ustalania płci w badaniach prenatalnych i in.
PCR daje się stosunkowo łatwo zastosować jako technika laboratoryjna. Materiałem wyjściowym do amplifikacji jest DNA zawierający interesującą nas sekwencję. Ponieważ sekwencja ta określona jest przez primery użyte do reakcji, nie jest konieczne izolowanie samej sekwencji. Ilość DNA stosowanego do PCR jest bardzo mała (teoretycznie wystarczy jedna cząsteczka DNA). Do mieszaniny reakcyjnej, oprócz DNA, dodaje się nadmiar primerów (dwa rodzaje primerów określających miejsce startu replikacji na każdej nici), polimerazę DNA, odpowiedni bufor zawierający magnez oraz mieszaninę 4 prekursorów DNA, tj.dezoksyrybonukleotydów (dNTP). Powodzenie reakcji PCR wymaga właściwego doboru następujących parametrów:
1) starterów reakcji amplifikacji (primerów). Projektując startery reakcji PCR, należy je dobrać tak, aby:
- starter zawierał około 50% par GC,
- starter był wysoko specyficzny dla danej sekwencji,
- odległość między starterami w amplifikowanym DNA wynosiła 0.1 do 3 kb (o ile używana jest Taq polimeraza),
- startery nie tworzyły struktur typu hairpin lub konkatamerów,
- długość primerów wynosiła około 20-30 zasad,a temperatura ich topnienia 50-60oC,
- startery nie powinny zawierać w 3' końcowej części fragmentów komplementarnych do siebie samych oraz do drugiego startera,
2) parametrów reakcji amplifikacji (stężenia dNTP, polimerazy, starterów, magnezu). Do reakcji PCR używa się polimerazy z Thermus aquaticus (Taq polimeraza) lub inne termostabilne polimerazy DNA (np. Pfu, Pwo, Vent). Mają one tę przewagę nad innymi polimerazami DNA, że są stabilne nawet w 94oC (optimum temperaturowe wynosi 72oC), a więc mogą być dodane jednorazowo na samym początku reakcji PCR, nie ulegając dezaktywacji w trakcie kolejnych cykli podgrzewania,
3) warunków samej reakcji PCR (temperatury, czasy trwania cykli itp). Optymalne temperatury annealingu dla starterów można dobrać wykorzystując m.in. program OLIGO. Czasy i temperatury w dużym stopniu zależą od wielkości produktów otrzymywanych w procesie amplifikacji oraz sekwencji i długości starterów.
Reakcję prowadzi się w objętości 10-50 ul pod warstwą oleju parafinowego lub wosku, zapobiegającą parowaniu. Probówki z PCR umieszcza się w specjalnym aparacie (ang. thermal cycler), w którym programuje się czas trwania i liczbę cykli oraz temperaturę poszczególnych etapów reakcji. Zwykle stosuje się 25-35 cykli.
Celem doświadczenia wykonywanego w ramach ćwiczeń jest zamplifikowanie segmentu DNA z genomu Drosophila melanogaster lub Arabidopsis thaliana.
Odczynniki i aparatura:
- bufor do Taq polimerazy (10x stężony),
- MgCl2 (roztwór o stężeniu 25 mM),
- primery (stężenie 2.0 uM),
- genom D.melanogaster lub A.thaliana,
- mieszanina dNTP,
- Taq polimeraza (0.25 U/ul),
- olej mineralny,
- standard wielkości DNA,
- agaroza,
- bufor TBE (45 mM Tris-boran, 1 mM EDTA),
- bromek etydyny (10 mg/ml),
- barwnik do elektroforezy,
- sterylne probówki Eppendorfa 0.5 ml,
- aparat do elektroforezy,
- aparat do PCR.
Wykonanie:
- odpipetować do probówek Eppendorfa: dNTP (40 uM), 10xbufor (1x), starter I (0.2 uM), starter II (0.2 uM), DNA genomowe, MgCl2 (1.5 mM), dopełnić wodą do 45 ul, (podano stężenia końcowe),
- odpipetować do probówki kontrolnej I: wszystko oprócz starterów,
probówki kontrolnej II: wszystko oprócz matrycy DNA,
- zalać olejem mineralnym (kropla),
- po wstępnej denaturacji matrycy w temperaturze 800C dodać 5 ul Taq polimerazy,
- ustawić 30 cykli w aparacie do PCR w odpowiednich warunkach,
- produkt amplifikacji zanalizować na żelu agarozowym wobec standardu wielkości.