Znanych jest wiele metod odzyskiwania DNA z żeli, żadna z nich jednak nie jest pozbawiona wad. Do głównych problemów podczas izolowania DNA z żeli należą:
1) obecność inhibitorów reakcji enzymatycznych. Większość handlowych preparatów agarozy, zwłaszcza w przeszłości, zanieczyszczona była polisacharydami działającymi hamująco na aktywność enzymów używanych w trakcie dalszej obróbki klonowanego DNA. Mimo znacznego postępu w jakości produkowanej agarozy nadal zdarza się izolowanie DNA w formie nieaktywnej.
2) mało skuteczne odzyskiwanie dużych fragmentów DNA. Wydajność izolowania fragmentów DNA z żelu jest funkcją ich ciężaru cząsteczkowego. Jak dotąd, brak jest naprawdę skutecznych metod dla fragmentów DNA dłuższych od 5 kb, które trudno wiążą się do DEAE-Sephacelu czy DEAE-celulozy i równie trudno się z nich eluują.
3) nieskuteczne odzyskiwanie małych ilości DNA. Im mniejsza ilość DNA na żelu, tym mniejsza wydajność jego odzyskiwania. Dlatego metod tych nie poleca się, gdy ilość DNA jest mniejsza od 500 ng.
4) brak możliwości odzyskania jednocześnie kilku fragmentów o różnej długości.
Metoda izolowania DNA z użyciem DEAE-celulozy polega na "złapaniu" migrującego w żelu DNA na umieszczoną w żelu membranę z DEAE-celulozą. Membranę z DNA odpłukuje się od zanieczyszczeń buforem o niskiej sile jonowej, a następnie eluuje się DNA (bufor o wysokiej sile jonowej). DNA o długości od 500 bp do 5 kb odzyskiwane jest z dużą wydajnością, a jego czystość jest bardzo wysoka. Z membran nie eluuje się jednak jednoniciowe DNA (ssDNA) oraz fragmenty powyżej 15 kb.
Elektrślucja do woreczków dializacyjnych jest najmniej wygodną ze stosowanych technik, ale okazała się najefektywniejsza w izolowaniu dużych fragmentów DNA (powyżej 5 kb), mało wydajnie izolowanych innymi metodami.
Izolacja fragmentu DNA z użyciem DEAE-celulozy
Odczynniki i aparatura:
- DNA do izolacji,
- papierki z DEAE-celulozą (preparat handlowy),
- 10 mM EDTA (pH 8.0),
- 0.5 M NaOH,
- agaroza,
- bufor TBE (45 mM Tris-boran, 1 mM EDTA),
- bromek etydyny (10 mg/ml),
- barwnik do elektroforezy,
- bufor A: 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.15 M NaCl, 10 mM EDTA (pH 8.0),
- bufor B: 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1.0 M NaCl, 10 mM EDTA (pH 8.0),
- mieszanina fenol : chloroform : alkohol izoamylowy (25:24:1) pH 8.0,
- 3 M octan sodu,
- etanol 96 %,
- etanol 70 %,
- bufor TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA),
- aparat do elektroforezy,
- skalpel lub żyletka,
- probówki Eppendorfa,
- łaYnia wodna lub heat-block na 65oC,
- mikrowstrząsarka Vortex,
- mikrowirówka.
Wykonanie:
- pasek z DEAE-celulozą zanurzyć na 5 minut w roztworze 10 mM EDTA (pH 8.0),
- pasek przenieść na 5 minut do roztworu 0.5 M NaOH,
- przepłukać 6-krotnie sterylną bidestylowaną wodą (tak przygotowana DEAE-celuloza może być przechowywana w lodówce w sterylnej wodzie przez kilka tygodni),
- przygotować żel agarozowy w buforze TBE (dodać bromku etydyny do stężenia 0.5 ug/ml), prowadzić elektroforezę do czasu, gdy prążek DNA, który ma być izolowany, stanie się widoczny,
- używając ostrego skalpela lub żyletki, naciąć agarozę tuż przed prążkiem DNA, który ma być izolowany; nacięcie powinno być szersze niż prążek o około 2mm z obu stron,
- umieścić w nacięciu papierek z DEAE-celulozą tak, aby nie znalazły się razem z nim pęcherze powietrza,
- kontynuować elektroforezę (5 V/cm) do czasu, aż całe izolowane DNA znajdzie się na papierku,
- zatrzymać elektroforezę, wyjąć papierek i przepłukać w 5 - 10 ml buforu A,
- przenieść papierek do eppendorfówki i dodać buforu B tak, aby papierek był całkowicie przykryty,
- wstawić probówkę na 30 minut do 65oC,
- zwirować 5 minut, supernatant przenieść do nowej probówki,
- do papierka dodać drugą objętość buforu B i inkubować kolejne 15 minut w 65oC,
- połączyć ze sobą dwie objętości buforu B, dodać równą objętość mieszaniny fenol:chloroform:alkohol izoamylowy, zamieszać na vortexie, zwirować 5 minut,
- przenieść fazę wodną (górną) do nowej probówki,
- dodać 1/10 objętości 3 M octanu sodu i 2.5 objętości zimnego etanolu 96 %, wsawić do -20oC na 15 - 30 minut,
- zwirować co najmniej 15 minut w mikrowirówce,
- osad przemyć 70 % etanolem, wysuszyć i zawiesić w buforze TE,
- sprawdzić ilość odzyskanego DNA na żelu agarozowym.
Elektrślucja do woreczków dializacyjnych
Odczynniki i aparatura:
- woreczki dializacyjne przygotowany w następujący sposób: gotować woreczki 10 minut w dużej objętości NaHCO3 i 1 mM EDTA (pH 8.0), przepłukać wodą bidestylowaną, gotować 10 minut w 1 mM EDTA (pH 8.0), schłodzić (tak przygotowane woreczki mogą być przechowywane w lodówce w sterylnej wodzie przez kilka tygodni),
- agaroza,
- bufor TBE (45 mM Tris-boran, 1 mM EDTA),
- bromek etydyny (10 mg/ml),
- barwnik do elektroforezy,
- 3 M octan sodu,
- etanol 96 %,
- etanol 70 %,
- bufor TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA),
- aparat do elektroforezy,
- skalpel lub żyletka,
- probówki Eppendorfa,
- mikrowirówka.
Wykonanie:
- przygotować żel agarozowy w buforze TBE (dodać bromku etydyny do stężenia 0.5 ug/ml), prowadzić elektroforezę do czasu, gdy prążek DNA, który ma być izolowany, stanie się widoczny,
- używając ostrego skalpela lub żyletki, wyciąć z żelu prążek DNA, które ma być izolowane,
- umieścić fragment agarozy w woreczku dializacyjnym w jak najmniejszej objętości buforu 0.5 x TBE i zamknąć woreczek tak, aby nie pozostały w środku pęcherze powietrza,
- umieścić tak przygotowany woreczek w aparacie do elektroforezy i prowadzić elektroforezę przy napięciu 5 V/cm,
- po 1 godzinie odwrócić bieguny i prowadzić elektroforezę przez około 1 minutę (uwolnienie DNA ze ścian woreczka),
otworzyć woreczek, wyjąć fragment agarozy i starannie przenieść bufor do probówki Eppendorfa,
- woreczek przemyć małą ilością buforu 0.5 x TBE i przenieść bufor do probówki Eppendorfa,
- dodać 1/10 objętości 3 M octanu sodu i 2.5 objętości zimnego etanolu 96 %, wsawić do -20oC na 15 - 30 minut,
- zwirować co najmniej 15 minut w mikrowirówce,
- osad przemyć 70 % etanolem, wysuszyć i zawiesić w buforze TE,
- sprawdzić ilość odzyskanego DNA na żelu agarozowym.
Szybka metoda izolacji DNA z żelu agarozowego ("freeze-squeeze")
Odczynniki i aparatura:
- agaroza,
- bufor TBE (45 mM Tris-boran, 1 mM EDTA),
- bromek etydyny (10 mg/ml),
- barwnik do elektroforezy,
- ciekły azot,
- silikonowana wata szklana,
- 3 M octan sodu,
- etanol 96 %,
- etanol 70 %,
- bufor TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA),
- aparat do elektroforezy,
- skalpel lub żyletka,
- probówki Eppendorfa (1.5 ml i 0.5 ml),
- mikrowirówka.
Wykonanie:
- przygotować żel agarozowy w buforze TBE (dodać bromku etydyny do stężenia 0.5 ug/ml), prowadzić elektroforezę do czasu, gdy prążek DNA, który ma być izolowany, stanie się widoczny,
- używając ostrego skalpela lub żyletki, wyciąć z żelu prążek DNA, które ma być izolowane,
- wycięty fragment żelu umieścić w probówce Eppendorfa i zamrozić w ciekłym azocie,
- odciąć od probówki Eppendorfa 0.5 ml (probówka Nr 1) górną jej część, a na dnie zrobić kilka dziurek ostrą igłą,
- w kolejnej probówce Eppendorfa 0.5 ml (probówka Nr 2) zrobić na dnie jedną dziurkę i umieścić małą ilość silikonowanej waty szklanej,
- przełożyć zamrożoną agarozę do probówki Nr 1,
- probówki złożyć tak, aby probówka Nr 1 znalazła się w probówce Nr 2, a ta w probówce 1.5 ml,
- zwirować 5 - 10 minut w mikrowirówce,
- zebrać bufor i dodać 1/10 objętości 3 M octanu sodu i 2.5 objętości zimnego etanolu 96 %, wsawić do -20oC na 15 - 30 minut,
- zwirować co najmniej 15 minut w mikrowirówce,
- osad przemyć 70 % etanolem, wysuszyć i zawiesić w buforze TE,
- sprawdzić ilość odzyskanego DNA na żelu agarozowym.