Bakteria glebowa Agrobacterium tumefaciens powoduje powstawanie guzów we wszystkich badanych pod tym względem roślinach dwuliściennych i w niektórych jednoliściennych. Za tworzenie się guzów odpowiedzialny jest plazmid Ti (ang. tumor inducing). Fragment tego plazmidu przenoszony jest do komórki roślinnej i stabilnie integruje w genom. Zawarte w tym fragmencie geny ulegają ekspresji w komórce roślinnej. Integrujący fragment nazwano T-DNA (transferred DNA). Analiza genetyczna wykazała, że dwa regiony plazmidu Ti są niezbędne do powstania guza: T-DNA i region vir (virulence). Mutacje we fragmencie T-DNA zmieniają morfologię guza, natomiast mutacje w regionie vir zaburzają jego powstanie. T-DNA zawiera geny które są związane z produkcją fitohormonów (auksyn, cytokinin, kwasu indolilooctowego). Nadprodukcja tych hormonów podwyższa tempo podziału komórki, zapobiega różnicowaniu i w rezultacie powoduje powstanie guza. Inne geny T-DNA odpowiedzialne są za syntezę aminokwasów i pochodnych cukrowych zwanych opinami, oraz za ich wydzielanie z komórki roślinnej. Opiny zawarte w guzie tkanki roślinnej mogą służyć jako Yródło węgla i azotu dla Agrobacterium.
Wykazano, że obszar T-DNA zawiera sekwencje niezbędne do przeniesienia go do komórki roślinnej. Niezbędny do przeniesienia T-DNA jest region vir, który jest aktywny nawet gdy znajduje się w innym replikonie. Wiadomo, że powtórzenia sekwencji o długości 25 bp tworzące granice T-DNA są niezbędne, ale i wystarczające aby region ten stabilnie integrował w genom roślinny. DNA zawarty między granicznymi sekwencjami przenoszony jest do komórki roślinnej z pomocą białek kodowanych przez geny znajdujące się w regionie vir, a następnie integruje w genom roślinny. Odkrycie mechanizmu tego zjawiska umożliwiło skonstruowanie wektorów używanych obecnie do transformacji komórek roślinnych z wykorzystaniem Agrobacterium.
Proces manipulowania plazmidem wprowadzanym do rośliny, można podzielić na dwa etapy :
1. Klonowani i zmiany w DNA prowadzone w bakteriach E.coli
2. Wprowadzenie gotowego konstruktu do Agrobacterium, które służy do transformacji rośliny.
Poniżej przedstawiono dwie metody wprowadzania plazmidu do Agrobacterium.
Elektroporacja
Odczynniki i aparatura:
- lektroporator, kuwetki do elektroporacji, sterylne końcówki do pipet, sterylne probówki wirownicze, pożywka YEB, roztwór MgSO4, rifampicyna, kanamycyna, szalki z pożywką YEB + rif 25+ kan 50, wybrany plazmid, woda sterylna, szczep Agrobacterium LBA 4404.
Wykonanie:
- nocną hodowlę bakterii w pożywce YEB z dodatkiem MgSO4 (stężenie końcowe 2mM) i rifampicyny (stężenie końcowe 25ug/ml) zwirować przez 10 minut w 4oC przy 5000 obr/min w rotorze SS34 (wirówka Sorvall),
- przepłukać w 20 ml sterylnej lodowatej wody bidestylowanej, zwirować w takich samych warunkach jak poprzednio, płukanie powtórzyć 4 razy,
- osad bakteryii zawiesić w 1ml sterylnej lodowatej wody bidestylowanej,
- do 100ul tak przygotowanych bakterii dodać około 500 ng plazmidowego DNA,
- przenieść do kuwetki do elektroporacji, transformować przy następujących parametrach:
200 W
25 uF
2.5 KV
- dodać do kuwetek 400 ul pożywki YEB ( tuż po przeprowadzeniu elektroporacji ),
- inkubować 2 godziny w 28oC,
- wysiać na szalki z pożywką YEB + rif 25+ kan 50
" Triparental mating " (Koniugacja trójrodzicielska)
W trakcie pocesu Triparental mating zachodzi jednoczesna koniugacja między trzema szczepami: szczepem E.coli zawierającym konstrukt, szczepem E.coli zawierającym plazmid pomocniczy oraz Agrobacterium. (E.coli-E.coli-Agrobacterium)
Odczynniki i aparatura:
- sterylne końcówki do pipet, sterylne probówki wirownicze, szalki z pożywką LB, szalki z pożywką LB + rif 25+ kan 50, płynna pożywka LB,10mM MgSO4,
Szczepy bakteryjne:
- szczep E.coli (DH5a ) zawierający plazmid, który ma być wprowadzony do Agrobacterium, a następnie użyty do transformacji roślin,
- szczep E.coli (HB101) zawierający plazmid pomocniczy pRK 2013,
- szczep Agrobacterium LBA 4404.
Wykonanie:
- hodowle nocne bakterii o objętości 2 ml zwirować przy 5000 obr/min 5 minut,
- przepłukać w 2 ml 10 mM MgSO4,
- zwirować ponownie w tych samych warunkach,
- zawiesić w 2 ml pożywki LB,
- na szalkę z pożywką LB podzieloną na 4 pola nanieść bakterie według podanego schematu:
25 ul Agrobacterium (A)
5 ul DH5a (P)
5 ul HB 101 (H)
- szalki pozostawić otwarte pod laminarem do wyschnięcia,
- szalki inkubować w 28oC przez 24 godziny,
- wykonać posiew redukcyjny pobierając bakterie z pola oznaczonego numerem 1 na szalkę z pożywką LB + rif 25+ kan 50,
- szalki inkubować w 28oC przez 48 godzin.