Opracowano wiele technik przenoszenia i ekspresji obcych genów w komórkach roślinnych. Umożliwia to badania nad ekspresją interesujących genów, otrzymywanie ulepszonych odmian stosowanych w rolnictwie, przemyśle farmaceutycznym czy innych gałęziach produkcyjnych. Metoda transformacji roślin via Agrobakterium jest często stosowana i przynosi dobre wyniki, choć nie wszystkie rośliny można transformować tą drogą. Znane są metody wykorzystujące wirusowe genomy i ich do zdolność infekcji komórek. Metody te mają istotne ograniczenia. Po pierwsze niektóre wirusy są patogenne, po drugie za pomocą wirusa można wprowadzać tylko niewielkie fragmenty DNA i, co równie istotne, przeniesiony tą drogą DNA nie jest przekazywany potomstwu. Możliwe jest także wprowadzanie bezpośrednio obcego DNA do komórek roślinnych, wiąże się to jednak z otrzymywaniem protoplastów , a następnie regenerowaniem z nich rośliny co możliwe jest tylko w przypadku niektórych gatunków. Przedstawione poniżej metody transformacji plazmidem Ti Agrobacterium thumefaciens są łatwe, a metoda transformacji siewek jest szybka i wydajna.
Materiały:
- sterylnie hodowane rośliny tytoniu
- szczep Agrobacterium LBA4404 zawierający odpowiedni plazmid
- pożywka YEB z dodatkiem odpowiednich antybiotyków
- 0.2 M CaCl2
- płynna pożywka MS wg Murashige-Skoog 1962, szalki ze stałą pożywką MST (MS plus hormony) z antybiotykami i bez nich
- sterylna bibuła, sterylny skalpel i sterylne pęsety, sterylne probówki wirownicze, wirówka Sorvall
- cieplarka , laminar, szafa hodowlana
A. Przygotowanie bakterii
- zaszczepić hodowlę nocną bakterii Agrobacterium w pożywce YEB (z dodatkiem odpowiednich antybiotyków), hodowlę prowadzić w temperaturze 28oC
- następnego dnia z uzyskanej hodowli zaszczepić 30 ml pożywki YEB (30 ul hodowli na 30 ml pożywki, dodać odpowiednie antybiotyki), hodowlę prowadzić przez noc w temperaturze 28oC.
- bakterie odwirować 10 min 5000 rpm
- osad bakterii zawiesić w 10 ml 0.2 M CaCl2, ponownie odwirować w tych samych warunkach, płukanie powtórzyć jeszcze raz.
- osad bakterii zawiesić w 10 ml 0.2 M CaCl2
B. Transformacja krążków liściowych
- na dużą szalkę Petriego wyłożyć 3 kilka liści tytoniu rosnącego w warunkach sterylnych.
- liście zwilżyć płynną pożywką MS, wyciąć główne nerwy, a pozostałą część liścia pokroić na fragmenty o wielkości około 0.5 cm2.
- przygotowane eksplantaty przenieść do nowej szalki i zalać wcześniej przygotowanymi bakteriami na 30 min.
- fragmenty liści osuszyć na sterylnej bibule i wyłożyć na pożywkę stałą MST.
- kokultywację prowadzić przez 5 dni w 260C (fotoperiod 16h)
- po upływie tego czasu eksplantaty przenieść na nowe podłoże MST z dodatkiem antybiotyków (claforan o stęż. 500 mg/l, i odpowiedniego antybiotyku selekcyjnego)
- hodowlę prowadzić jak wyżej , eksplantaty przenosić na nowe podłoże co około 10 dni.
- regenerujące pędy o długości około 1 cm odcinać od kalusa i wykładać na stałe podłoże MS z dodatkiem antybiotyku selekcyjnego.
- po ukorzenieniu roślinki przenieść do doniczek z ziemią.
YEB - ekstrakt wołowy 5 g/l, ekstrakt drożdżowy 5 g/l, pepton 5 g/l, sacharoza 5 g/l, 2mM MgSO4.
MST- na 1 litr : makrślementy 10x-100 ml, mikrślementy 1000x-1ml, witaminy 1000x-1ml, Fe-EDTA 100x-10ml, myo-inozytol - 100mg, sacharoza 30g, NAA-0,1mg/l, BAP-1.0 mg/l, glicyna 1000x-1ml, pH 5.8.