Materiały:
- sterylnie hodowane rośliny tytoniu,
- szczep Agrobacterium LBA4404 zawierający odpowiedni plazmid,
- pożywka YEB z dodatkiem odpowiednich antybiotyków,
- 10mM MgSO4,
- kuwetki do spektrofotometru, spektrofotometr,
- płynna pożywka MS wg Murashige-Skoog 1962, szalki ze stałą pożywką MS, szalki ze stałą pożywką MST (MS plus hormony) z antybiotykami ,
- sterylna bibuła, sterylny skalpel i sterylne pęsety, sterylne probówki wirownicze, wirówka Sorvall,
- cieplarka , laminar, szafa hodowlana, pompa próżniowa, eksykator,
A. Przygotowanie bakterii
- zaszczepić hodowlę nocną bakterii Agrobacterium w pożywce YEB (z dodatkiem odpowiednich antybiotyków), hodowlę prowadzić w temperaturze 28oC.
- następnego dnia z uzyskanej hodowli zaszczepić 30 ml pożywki YEB (30 ul hodowli na 30 ml pożywki, dodać odpowiednie antybiotyki), hodowlę prowadzić przez noc w temperaturze 28oC.
- bakterie odwirować 10 min 5000 rpm
- osad bakterii zawiesić w 20 ml 10mM MgSO4, ponownie odwirować w tych samych warunkach , płukanie powtórzyć jeszcze dwa razy.
- osad bakterii zawiesić w 20 ml 10mM MgSO4,
B. Transformacja 2-3 tygodniowych siewek tytoniu
- 2-3 tygodniowe siewki tytoniu przenieść do sterylnej zakręcanej probówki o pojemności 15 ml, zalać wcześniej przygotowaną zawiesiną bakteryjną, wymieszać tak aby nie było bąbli powietrza,
- probówki wstawić do eksykatora (wcześniej wysterylizowanego), włączyć próżnię i po 5min wyłączyć , wokół roślinek powinny pojawić się bąbelki powietrza,
- rośliny odsączyć od bakterii na sterylnej bibule, a następnie rozłożyć na szalce z pożywką MS kokultywację prowadzić przez 3 dni w 260C (fotoperiod 16h),
- po 3 dniach roślinki przenieść na pożywkę MST z dodatkiem antybiotyków (claforan 500mg/l, oraz odpowiedniego antybiotyku selekcyjnego),
- hodowlę prowadzić w warunkach podanych wyżej, eksplantaty przenosić na nowe podłoże co około 7 dni,
- regenerujące pędy o długości około 1 cm odcinać od kalusa i przenosić na podłoże MS z antybiotykami,
- po ukorzenieniu rośliny można przenosić do ziemi.
YEB - ekstrakt wołowy 5 g/l, ekstrakt drożdżowy 5 g/l, pepton 5 g/l, sacharoza 5 g/l, 2mM MgSO4.
MST- na 1 litr : makrślementy 10x-100 ml, mikrślementy 1000x-1ml, witaminy 1000x-1ml, Fe-EDTA 100x-10ml, myo-inozytol - 100mg, sacharoza 30g, NAA-0,1mg/l, BAP-1.0 mg/l, glicyna 1000x-1ml, pH 5.8.