Rozwój inżynierii genetycznej roślin wyższych, a w szczególności gatunków ważnych gospodarczo, napotyka na rozliczne problemy. Dotyczy to szczególnie tak ważnej dla człowieka grupy roślin jak zboża. O ile bowiem metody wprowadzania obcego DNA do roślin dwuliściennych w przypadku wielu gatunków zostały opracowane i poznane w stopniu umożliwiającym niemalże rutynowe otrzymywanie roślin transgenicznych, to próby transformowania jednoliściennych, a w szczególności zbóż, kończyły się niepowodzeniem. Wynika to z ograniczonej przydatności Agrobacterium tumefaciens, z powodzeniem stosowanej w transformacjach roślin dwuliściennych, do wprowadzania obcej informacji genetycznej do zbóż i innych jednoliściennych.
Przełomem w inżynierii genetycznej zbóż okazała się opracowana i opisana w 1987 przez Sanforda i współpracowników metoda nazywana techniką biolistyczną lub biobalistyczną bądż też mikrowstrzeliwaniem, a w literaturze angielskojęzycznej znana jako microprojectile bombardment. Polega ona na wstrzeliwaniu mikroskopijnego śrutu opłaszczonego preparatem DNA do żywej tkanki. Urządzenie nadające takim mikropociskom potrzebną szybkość nazywane jest strzelbą genową (gene gun, macron accelerator, particle inflow gun, particle gun). W dostęnych publikacjach spotyka się bardzo różne mechanizmy rozpędzania mikropocisków: sprężony gaz, przenoszenie impulsu mechanicznego, wystrzeliwanie makronośników, siła odśrodkowa, czy też impuls elektryczny wytwarzający sprężoną parę wodną. Spośród wielu konstrukcji szczególnie przydatne okazały się dwie: opisana przez Sanforda, gdzie odpalenie ślepego naboju rozpędzało nylonowy makronośnik wypełniony mikronośnikami, które leciały w kierunku celu gdy rozpędzony makronośnik był zatrzymywany na siatce zatrzymującej, oraz zaproponowany przez tenże zespół model, w którym makronośnik napędzany był sprężonym helem.
Strzelba genowa Biolistic PDS 1000/He produkcji firmy Bio- Rad jest przykładem drugiego rozwiązania: ciśnienie helu w lufie powoduje pęknięcie zamykającej ją przepony, uwolniony strumień gazu wyrywa makronośnik z uchwytu i uderza nim o siatkę zatrzymującą; to powoduje z kolei wybicie z jego powierzchni mikronośników, które uderzają i wbijają się w transformowaną tkankę.
Materiały:
- plazmid pAHC25,
- płytki z pożywką MS+ 2, 4- D, 2 mg/l,
- niedojrzałe, 12- 14- dniowe nasiona pszenicy odm. Chinese Spring,
- roztwory: 2.5M CaCl2 (lub Ca(NO4)2), 0.1M spermidyna, etanol 70% i 100%, stock X- Gluc/DMSO, bufor inkubacyjny do testu histochemicznego GUS (370 mg Na2EDTA ´ 2 H2O, 16.5 mg K2Fe(CN)4, 100 m l Triton X- 100, 1.2 g Na2HPO4. Rozpuścić w 100 ml H2O, doprowadzić pH do 7.0 stężonym NaOH).
- komora laminarna,
- lupa binokularna,
- pipety automatyczne i końcówki do pipet,
- wirówka laboratoryjna,
- zawiesina mikronośników,
- makronośniki,
- uchwyty makronośników,
- przepony 1100 psi,
- pen- vac,
Wykonanie:
a) przygotowanie materiału roślinnego do transformacji,
- nasiona zanurzyć na chwilę w 70% EtOH, 3 razy przemyć wodą sterylną,
- zanurzyć na 10 min. w 20% roztworze CloroxŇ (lub innego środka wybielającego zawierającego 52% podchlorynu sodu) z dodatkiem 1- 2 kropli Tween- 80, przemyć wodą sterylną,
- wyizolowane zarodki wyłożyć na sterylne szalki Petriego z pożywką MS, płytki zakleić umieścić w pokoju hodowlanym, w temperaturze 27oC przy oświetleniu stałym o natężeniu 900 luksów; hodując kalus embriogenny w celu uzyskania roślin z zarodków somatycznych pasaże przeprowadzać co ok. 30 dni.
b) opłaszczanie opiłków wolframowych,
- do 50 m l zawiesiny opiłków dodawać, cały czas worteksując, kolejno: 5 m l DNA (1 m g/m l), 50 m l 2.5M CaCl2 (lub Ca(NO4)2), 20 m l 0.1M spermidyny, zworteksować 3 min., pozostawić w lodzie na 10 min.,
- zwirować przy 10000 rpm, 10 sek. usunąć część lub całość supernatantu (wg potrzeb),
- płukać 200m l 100% etanolu, szybko zworteksować, zwirować, usunąć supernatant,
- zawiesić w 60 m l 100% etanolu,
- plastikowe makronośniki przemyć chloroformem lub etanolem w celu usunięcia śladów tłuszczu, osuszyć, umieścić w sterylnym makronośniku,
- cały czas worteksując, odpipetować 5- 10 m l zawiesiny opiłków na środek każdego makronośnika, pozostawić do wyschnięcia,
c) transformacja,
- wszystkie ruchome elementy strzelby wyjąć z komory, rozłożyć, sterylizować 70% etanolem, także wnętrze strzelby spryskać dokładnie etanolem, pozostawić do wyschnięcia,
- odkręcić główny zawór butli z helem,
- włączyć strzelbę genową (przycisk ON/OFF na panelu kontrolnym) i pompę próżniową,
- otworzyć zawór łączący butlę z helem ze strzelbą genową, ustawić ciśnienie na poziomie o 200 psi wyższym od używanego w procesie transformacji,
- przeponę o odpowiedniej wytrzymałosci umieścić w uchwycie przepony, uchwyt nakręcić na wylot lufy,
- wyjałowione elementy strzelby złożyć (patrz rys. 4),
- włożyć uchwyt z makronośnikiem, przykręcić przykrywkę,
- zamknąć drzwiczki aparatu, rozpocząć wytwarzanie próżni w komorze aparatu (przycisk VAC/VENT/HOLD w pozycji VAC), po osiągnięciu żądanej próżni (odczyt na manometrze poniżej panelu kontrolnego) zatrzymać pompę próżniową (przycisk VAC/VENT/HOLD w pozycji HOLD),
- wcisnąć przycisk FIRE, zwolnić go natychmiast po ?strzale?,
- zlikwidować próżnię w komorze aparatu (przycisk VAC/VENT/HOLD w pozycji VENT), gdy ciśnienie wewnątrz strzelby wyrówna się z ciśnieniem atmosferycznym próżni (odczyt na manometrze poniżej panelu kontrolnego), można otworzyć drzwiczki aparatu,
- wyjąć płytkę z ?ostrzelanym? materiałem, zalepić ją paskiem folii lub parafilmu,
Rys. 1. Układ przycisków na panelu kontrolnym strzelby genowej.
Rys. 3. Uchwyt przepony z umieszczoną wewnątrz przeponą. Rys. 2. 1, uchwyt makronośnika; 2, makronośnik; 3, przykrywka; 4,
? układ ładowania?; 5, siatka zatrzymująca; 6, sprężyna dociskająca; 7, uchwyt siatki; 8, pierścienie regulujące odległość siatka: cel; 9, ?półka?; 10, gwintowany cylinder.
d) test histochemiczny GUS,
- do buforu inkubacyjnego dodać 100 m l stock? u X- Gluc/DMSO,
- z każdej płytki wybrać losowo 3- 5 zarodków, inkubować w buforze inkubacyjnym w temp. 37oC przez 12- 24 godz.,