Metoda Southerna polega na hybrydyzacji wyznakowanej sondy do fragmentów DNA rozdzielonych w żelu agarozowym, a następnie przeniesionych na filtr nylonowy lub nitrocelulozowy.
Po rozdziale na żelu, DNA zostaje zdenaturowany pod wpływem NaOH, a następnie poddaje się go działaniu roztworu neutralizującego o pH 7.4 (wysokie pH uniemożliwia wiązanie się DNA z filtrem). Następnie przenosi się fragmenty DNA z żelu na filtr, umożliwia to siła ssąca bibuły ( w tej procedurze bibułę zastępują pieluszki higieniczne). Przeniesienie DNA z żelu na filtr nazywamy transferem. DNA zostaje związane z filtrem przez zapiekanie w 80oC lub przez naświetlanie światłem UV.
Transfer DNA z żelu agarozowego na filtr nylonowy ( Southern blot )
Materiały :
- filtr nylonowy, bibuła Whatman 3MM, szklana płytka, kuweta, folia spożywcza, pieluszki higieniczne jednorazowego użytku, parafilm.
- roztwory :
1.denaturujący 1.5M NaCl, 0.5M NaOH
2.neutralizujący 1M Tris (pH 8.0), 1.5M NaCl
3.20xSSC 3M NaCl, 0,3M cytrynian sodu, pH 7.0
Wykonanie :
- rozdzielić fragmenty DNA na żelu agarozowym, zabarwić bromkiem etydyny, przez odcięcie jednego z rogów zorientować żel, ułożyć wzdłuz ścieżek linijkę i sfotografować żel,
- żel umieścić w kuwecie z roztworem denaturującym, a kuwetę ustawić na kołysce laboratoryjnej,
- po 1 godzinie przepłukać żel wodą destylowaną i umieścić w roztworze neutralizujacym na 40 minut,
- żel przepłukać wodą destylowaną i ponownie umieścić w roztworze do neutralizacji na 40 minut, - następnie przepłukać wodą destylowaną i umieścić w roztworze 20xSSC na około 15 minut.
W trakcie neutralizacji żelu należy wyciąć filtr nylonowy i 3 kawałki bibuły Whatman 3MM o wymiarach żelu,
- filtr nylonowy wypłukać w wodzie, a następnie w roztworze 20xSSC (bibułę wystarczy zamoczyć w roztworze 20xSSC).
- na kuwecie umieścić szklaną płytkę, na której ułożyć warstwę bibuły Whatman 3MM, tak aby brzegi bibuły dotykały do dna kuwety, bibułę zmoczyć roztworem 20xSSC, tak aby między bibułą a płytką nie było pęcherzy powietrza, ten sam roztwór wlać do kuwety,
- na bibule położyć żel; pod żelem nie mogą znajdować się pęcherze powietrza; wzdłuż żelu ułożyć paski parafilmu, tak aby zachodziły na żel około 2mm,
- na żel położyć wcześniej przygotowany filtr nylonowy i 3 warstwy mokrej bibuly Whatman 3MM: nie pozostawiać pęcherzy powietrza !
- na bibule umieścić 2 warstwy pieluszek higienicznych i przycisnąć je 1 kg ciężarkiem; transfer prowadzić przez noc,
- usunąć górne warstwy przykrywające żel, na filtrze zaznaczyć długopisem kieszonki i odcięty róg żelu,
- wilgotny filtr położyć na transiluminatorze i " zapiekać " przez 2 minuty,
- filtr pozostawić do wyschnięcia.
Transfer DNA na filtr nylonowy
Hybrydyzacja
Wykonanie
Jeśli sonda jest w 100% homologiczna do poszukiwanego DNA, hybrydyzację należy prowadzić w 65oC.
- prehybrydyzację prowadzić w 65oC co najmniej przez 2 godziny:
roztwór do prehybrydyzacji:
5xDenhardt
5xSSC
0.1 mg/ml DNA ze spermy łososia
0.5% SDS
- następnie zmienić roztwór na roztwór do hybrydyzacji:
5xDenhardt
5xSSC
0.1 mg/ml DNA ze spermy łososia
0.1% SDS,
zawierający sondę wyznakowaną metodą " random priming,
- hybrydyzację prowadzić przez noc w temperaturze 65oC,
- po hybrydyzacj płukać filtr (w temperaturze 65oC) następująco:
1 godzina w 3xSSC, 0.1%SDS
1 godzina w 2xSSC, 0.1% SDS
1 godzina w 0.5xSSC, 0.1% SDS
1 godzina w 0.1xSSC, 0.1% SDS
Autoradiografia
Po hybrydyzacji filtr należy owinąć w folię (nie wolno dopuścić do wyschnięcia filtru) i zapakować do kasety zawierającej ekran wzmacniający promieniowanie b oraz kliszę rentgenowską i włożyć do zamrazrki -70oC . Czas ekspozycji dobrać w zależności od mocy sygnału. Do ekspozycji można także użyć urządzenia Phosphor-imager.
Uwaga! Filtru nie dotykać palcami ! Należy pracować w rękawiczkach !
OTRZYMYWANIE RNA Z ROŚLIN
Typowa komórka eukariotyczna zawiera około 10 -5 ug RNA, 80-85% stanowią rybosomalne RNA ( 28S, 18S i 5S ), pozostałe 10-15% to różne rodzaje małoczasteczkowego RNA
( tRNA, mały jądrowy RNA i inne ). Poszczególne klasy RNA mają określoną wielkość i można je izolować w stosunkowo nie zanieczyszczonej formie z wykorzystaniem technik takich jak elektroforeza, wirowanie w gradiencie gęstości czy chromatografia jonowymienna. Informacyjny RNA (mRNA) stanowi 1-5% całkowitej ilości RNA w komórce, jest zróżnicowany zarówno pod względem wielkości tak i sekwencji. Większość eukariotycznych cząsteczek mRNA posiada na końcu 3' sekwencję złożoną z reszt adenylowych poliA, co pozwala na oddzielenie mRNA od innych klas RNA za pomocą chromatografii powinowactwa na oligo(dT)-celulozie lub poli(U)-sefarozie.
Otrzymanie dobrej jakości RNA zależy od skutecznego zinaktywowania rybonukleaz. RNA-zy wytrzymują gotowanie i autoklawowanie, należy więc stosować specjalne metody chroniące przed ich działaniem. Są to:
1.prażenie szkła w 180oC, traktowanie wszystkich roztworów 0.1% DEPC (dwuetylopirowęglan) i następnie ich autoklawowanie, noszenie rękawiczek gumowych w trakcie pracy z RNA ( ręce są często głównym powodem zanieczyszczeń ).
(ochrona przed egzogennymi rybonukleazami)
2.inkubacja preparatu z proteinazą K, traktowanie thiocyjanianem guanidyny (który denaturuje białka) i b -merkaptoetanolem (redukuje mostki dwusiarczkowe).
(ochrona przed endogennymi rybonukleazami)
Odczynniki i aparatura:
- moYdzierz z tłuczkiem,
- probówki wirownicze szklane typu Corex i probówki Eppendorfa,
- końcówki do pipet,
- roztwór do ekstrakcji o składzie : 4M thiocyjanian guanidyny, 25 mM cytrynian sodu o pH 7.0, sarkozyl 0.5%, 0.1M b -merkaptoetanol, Uwaga! Roztwór przygotowywać zawsze tuż przed izolacją RNA
- 3M octanu sodu (NaAc) pH 4.8,
- fenol wysycony wodą,
- chloroform-izoamylowy alkohol (24:1),
- izopropanol,
- etanol 80% i 100%.
Uwaga!
Szkło (z wyjątkiem probówek typu corex) i moYdzierze używane do preparatyki RNA powinny być bardzo dokładnie umyte i wyprażone w 180oC przez co najmniej 3 godziny. Woda używana do robienia roztworów, końcówki do pipet, probówki Eppendorfa i probówki typu corex powinny być autoklawowane 2 razy !
Wykonanie
- utrzeć materiał roślinny w moYdzierzu na puder, z użyciem ciekłego azotu.
- Na 1 gram materiału dodać 3 ml roztworu do ekstrakcji, przelać do probówki typu Corex i energicznie wytrząsać w celu uzyskania jednorodnej emulsji,
- dodać następujące roztwory 0.2 ml 3M octanu sodu (NaAc) pH 4.8, 3 ml fenolu wysyconego wodą, 0.6 ml mieszaniny chloroform-alkohol izoamylowy (w stosunku 24:1),
- uzyskaną w ten sposób mieszaninę pozostawić w lodzie na 15 minut,
- zwirować w rotorze SS-34, 15000 obr 30 min. (wirówka Sorval),
- fazę wodną przenieść do nowych probówek i wymieszać z 1 objętością izopropanolu, pozostawić w -20oC na przynajmniej 1 godzinę,
- zwirować jak poprzednio,
- osad przepłukać w zimnym 80% etanolu, osuszyć w temperaturze pokojowej (Uwaga! Nie suszyć za mocno! ), zawiesić w około 300 ul zimnej wody (Uwaga! Nie zawieszać pipetą!), trzymać w lodzie.
- dodać 0.1 objętości 3M NaAc pH 4.8 i 2.5 objętości zimnego 100% etanolu, wymieszać i pozostawić na noc w -20oC lub przynajmniej 1 godzinę w -800
- przenieść mieszaninę do probówek Eppendorfa, zwirować w mikrowirówce w chłodni 15 min.
- osad przepłukać w zimnym 80% etanolu i dobrze wysuszyć.
- wysuszony osad zawiesić w 50 ul zimnej wody.
Znakowanie DNA metodą "random priming"
Metoda "random priming" oparta jest na hybrydyzacji przypadkowych heksanukleotydów (oligonukleotyd o długości 6 nukleotydów) do DNA, który ma być wyznakowany, a następnie dosyntetyzowanie komplementarnej nici od końca 3'OH przyłączonego hexanukleotydu przez polimerazę Klenowa. W mieszaninie reakcyjnej znajdują się zmodyfikowane trifosforany deoksynukleozydów wyznakowane [32P]-, [35S]-, [3H]-, lub biotyną (w zależności od tego czym ma być wyznakowana sonda), które włączane są do nowo syntetyzowanej nici komplementarnej. Długość znakowanych fragmentów nie wpływa na wydajność reakcji. Zarówno fragmenty krótkie o długości 200bp jak i całe zlinearyzowane plazmidy będą dobrze wyznakowane.
DNA nie ulega degradacji podczas reakcji, co umożliwia znakowanie nawet 10 ng DNA.
Mieszanina rekcyjna:
3 ul DNA do znakowania (150 ng)
7 ul wody
zdenaturować DNA (ogrzać w 100oC przez 10 min., a następnie wstawić do lodu)
dodać pozostałe składniki mieszaniny
3 ul mieszaniny dATP, dGTP, dTTP,
(każdy z nukleotydów w stężeniu 0.5mmol/l),
2 ul mieszaniny heksanukleotydów,
1 ul polimerazy Klenowa (2 U/ul),
5 ul - 50 uCi [a 32P] dCTP, 3000 Ci/mmol
Reakcje prowadzić przez 1 godz. w 37oC
Wyznakowane DNA oddzielić od mieszaniny trifosforanów nukleozydów na kolumience wypełnionej Sephadexem G-50
Uwaga! DEPC jest trujący !
Uwaga! Z RNA należy zawsze pracować w rękawiczkach !- włączyć strzelbę genową (przycisk ON/OFF na panelu kontrolnym) i pompę próżniową,
- otworzyć zawór łączący butlę z helem ze strzelbą genową, ustawić ciśnienie na poziomie o 200 psi wyższym od używanego w procesie transformacji,
- przeponę o odpowiedniej wytrzymałosci umieścić w uchwycie przepony, uchwyt nakręcić na wylot lufy,
- wyjałowione elementy strzelby złożyć (patrz rys. 4),
- włożyć uchwyt z makronośnikiem, przykręcić przykrywkę,
- zamknąć drzwiczki aparatu, rozpocząć wytwarzanie próżni w komorze aparatu (przycisk VAC/VENT/HOLD w pozycji VAC), po osiągnięciu żądanej próżni (odczyt na manometrze poniżej panelu kontrolnego) zatrzymać pompę próżniową (przycisk VAC/VENT/HOLD w pozycji HOLD),
- wcisnąć przycisk FIRE, zwolnić go natychmiast po ?strzale?,
- zlikwidować próżnię w komorze aparatu (przycisk VAC/VENT/HOLD w pozycji VENT), gdy ciśnienie wewnątrz strzelby wyrówna się z ciśnieniem atmosferycznym próżni (odczyt na manometrze poniżej panelu kontrolnego), można otworzyć drzwiczki aparatu,
- wyjąć płytkę z ?ostrzelanym? materiałem, zalepić ją paskiem folii lub parafilmu,
Rys. 1. Układ przycisków na panelu kontrolnym strzelby genowej.
Rys. 3. Uchwyt przepony z umieszczoną wewnątrz przeponą. Rys. 2. 1, uchwyt makronośnika; 2, makronośnik; 3, przykrywka; 4,
? układ ładowania?; 5, siatka zatrzymująca; 6, sprężyna dociskająca; 7, uchwyt siatki; 8, pierścienie regulujące odległość siatka: cel; 9, ?półka?; 10, gwintowany cylinder.
d) test histochemiczny GUS,
- do buforu inkubacyjnego dodać 100 m l stock? u X- Gluc/DMSO,
- z każdej płytki wybrać losowo 3- 5 zarodków, inkubować w buforze inkubacyjnym w temp. 37oC przez 12- 24 godz.,Mieszanina rekcyjna:
3 ul DNA do znakowania (150 ng)
7 ul wody
zdenaturować DNA (ogrzać w 100oC przez 10 min., a następnie wstawić do lodu)
dodać pozostałe składniki mieszaniny
3 ul mieszaniny dATP, dGTP, dTTP,
(każdy z nukleotydów w stężeniu 0.5mmol/l),
2 ul mieszaniny heksanukleotydów,
1 ul polimerazy Klenowa (2 U/ul),
5 ul - 50 uCi [a 32P] dCTP, 3000 Ci/mmol
Reakcje prowadzić przez 1 godz. w 37oC
Wyznakowane DNA oddzielić od mieszaniny trifosforanów nukleozydów na kolumience wypełnionej Sephadexem G-50
Uwaga! DEPC jest trujący !
Uwaga! Z RNA należy zawsze pracować w rękawiczkach !- włączyć strzelbę genową (przycisk ON/OFF na panelu kontrolnym) i pompę próżniową,
- otworzyć zawór łączący butlę z helem ze strzelbą genową, ustawić ciśnienie na poziomie o 200 psi wyższym od używanego w procesie transformacji,
- przeponę o odpowiedniej wytrzymałosci umieścić w uchwycie przepony, uchwyt nakręcić na wylot lufy,
- wyjałowione elementy strzelby złożyć (patrz rys. 4),
- włożyć uchwyt z makronośnikiem, przykręcić przykrywkę,
- zamknąć drzwiczki aparatu, rozpocząć wytwarzanie próżni w komorze aparatu (przycisk VAC/VENT/HOLD w pozycji VAC), po osiągnięciu żądanej próżni (odczyt na manometrze poniżej panelu kontrolnego) zatrzymać pompę próżniową (przycisk VAC/VENT/HOLD w pozycji HOLD),
- wcisnąć przycisk FIRE, zwolnić go natychmiast po ?strzale?,
- zlikwidować próMieszanina rekcyjna:
3 ul DNA do znakowania (150 ng)
7 ul wody
zdenaturować DNA (ogrzać w 100oC przez 10 min., a następnie wstawić do lodu)
dodać pozostałe składniki mieszaniny
3 ul mieszaniny dATP, dGTP, dTTP,
(każdy z nukleotydów w stężeniu 0.5mmol/l),
2 ul mieszaniny heksanukleotydów,
1 ul polimerazy Klenowa (2 U/ul),
5 ul - 50 uCi [a 32P] dCTP, 3000 Ci/mmol
Reakcje prowadzić przez 1 godz. w 37oC
Wyznakowane DNA oddzielić od mieszaniny trifosforanów nukleozydów na kolumience wypełnionej Sephadexem G-50
Uwaga! DEPC jest trujący !
Uwaga! Z RNA należy zawsze pracować w rękawiczkach !- włączyć strzelbę genową (przycisk ON/OFF na panelu kontrolnym) i pompę próżniową,
- otworzyć zawór łączący butlę z helem ze strzelbą genową, ustawić ciśnienie na poziomie o 200 psi wyższym od używanego w procesie transformacji,
- przeponę o odpowiedniej wytrzymałosci umieścić w uchwycie przepony, uchwyt nakręcić na wylot lufy,
- wyjałowione elementy strzelby złożyć (patrz rys. 4),
- włożyć uchwyt z makronośnikiem, przykręcić przykrywkę,
- zamknąć drzwiczki aparatu, rozpocząć wytwarzanie próżni w komorze aparatu (przycisk VAC/VENT/HOLD w pozycji VAC), po osiągnięciu żądanej próżni (odczyt na manometrze poniżej panelu kontrolnego) zatrzymać pompę próżniową (przycisk VAC/VENT/HOLD w pozycji HOLD),
- wcisnąć przycisk FIRE, zwolnić go natychmiast po ?strzale?,
- zlikwidować próżnię w komorze aparatu (przycisk VAC/VENT/HOLD w pozycji VENT), gdy ciśnienie wewnątrz strzelby wyrówna się z ciśnieniem atmosferycznym próżni (odczyt na manometrze poniżej panelu kontrolnego), można otworzyć drzwiczki aparatu,
- wyjąć płytkę z ?ostrzelanym? materiałem, zalepić ją paskiem folii lub parafilmu,
Rys. 1. Układ przycisków na panelu kontrolnym strzelby genowej.
Rys. 3. Uchwyt przepony z umieszczoną wewnątrz przeponą. Rys. 2. 1, uchwyt makronośnika; 2, makronośnik; 3, przykrywka; 4,
? układ ładowania?; 5, siatka zatrzymująca; 6, sprężyna dociskająca; 7, uchwyt siatki; 8, pierścienie regulujące odległość siatka: cel; 9, ?półka?; 10, gwintowany cylinder.
d) test histochemiczny GUS,
- do buforu inkubacyjnego dodać 100 m l stock? u X- Gluc/DMSO,
- z każdej płytki wybrać losowo 3- 5 zarodków, inkubować w buforze inkubacyjnym w temp. 37oC przez 12- 24 godz.,Mieszanina rekcyjna:
3 ul DNA do znakowania (150 ng)
7 ul wody
zdenaturować DNA (ogrzać w 100oC przez 10 min., a następnie wstawić do lodu)
dodać pozostałe składniki mieszaniny
3 ul mieszaniny dATP, dGTP, dTTP,
(każdy z nukleotydów w stężeniu 0.5mmol/l),
2 ul mieszaniny heksanukleotydów,
1 ul polimerazy Klenowa (2 U/ul),
5 ul - 50 uCi [a 32P] dCTP, 3000 Ci/mmol
Reakcje prowadzić przez 1 godz. w 37oC
Wyznakowane DNA oddzielić od mieszaniny trifosforanów nukleozydów na kolumience wypełnionej Sephadexem G-50
Uwaga! DEPC jest trujący !
Uwaga! Z RNA należy zawsze pracować w rękawiczkach !- włączyć strzelbę genową (przycisk ON/OFF na panelu kontrolnym) i pompę próżniową,
- otworzyć zawór łączący butlę z helem ze strzelbą genową, ustawić ciśnienie na poziomie o 200 psi wyższym od używanego w procesie transformacji,
- przeponę o odpowiedniej wytrzymałosci umieścić w uchwycie przepony, uchwyt nakręcić na wylot lufy,
- wyjałowione elementy strzelby złożyć (patrz rys. 4),
- włożyć uchwyt z makronośnikiem, przykręcić przykrywkę,
- zamknąć drzwiczki aparatu, rozpocząć wytwarzanie próżni w komorze aparatu (przycisk VAC/VENT/HOLD w pozycji VAC), po osiągnięciu żądanej próżni (odczyt na manometrze poniżej panelu kontrolnego) zatrzymać pompę próżniową (przycisk VAC/VENT/HOLD w pozycji HOLD),
- wcisnąć przycisk FIRE, zwolnić go natychmiast po ?strzale?,
- zlikwidować próżnię w komorze aparatu (przycisk VAC/VENT/HOLD w pozycji VENT), gdy ciśnienie wewnątrz strzelby wyrówna się z ciśnieniem atmosferycznym próżni (odczyt na manometrze poniżej panelu kontrolnego), można otworzyć drzwiczki aparatu,
- wyjąć płytkę z ?ostrzelanym? materiałem, zalepić ją paskiem folii lub parafilmu,
Rys. 1. Układ przycisków na panelu kontrolnym strzelby genowej.
Rys. 3. Uchwyt przepony z umieszczoną wewnątrz przeponą. Rys. 2. 1, uchwyt makronośnika; 2, makronośnik; 3, przykrywka; 4,
? układ ładowania?; 5, siatka zatrzymująca; 6, sprężyna dociskająca; 7, uchwyt siatki; 8, pierścienie regulujące odległość siatka: cel; 9, ?półka?; 10, gwintowany cylinder.
d) test histochemiczny GUS,
- do buforu inkubacyjnego dodać 100 m l stock? u X- Gluc/DMSO,
- z każdej płytki wybrać losowo 3- 5 zarodków, inkubować w buforze inkubacyjnym w temp. 37oC przez 12- 24 godz.,Mieszanina rekcyjna:
3 ul DNA do znakowania (150 ng)
7 ul wody
zdenaturować DNA (ogrzać w 100oC przez 10 min., a następnie wstawić do lodu)
dodać pozostałe składniki mieszaniny
3 ul mieszaniny dATP, dGTP, dTTP,
(każdy z nukleotydów w stężeniu 0.5mmol/l),
2 ul mieszaniny heksanukleotydów,
1 ul polimerazy Klenowa (2 U/ul),
5 ul - 50 uCi [a 32P] dCTP, 3000 Ci/mmol
Reakcje prowadzić przez 1 godz. w 37oC
Wyznakowane DNA oddzielić od mieszaniny trifosforanów nukleozydów na kolumience wypełnionej Sephadexem G-50
Uwaga! DEPC jest trujący !
Uwaga! Z RNA należy zawsze pracować w rękawiczkach !- włączyć strzelbę genową (przycisk ON/OFF na panelu kontrolnym) i pompę próżniową,
- otworzyć zawór łączący butlę z helem ze strzelbą genową, ustawić ciśnienie na poziomie o 200 psi wyższym od używanego w procesie transformacji,
- przeponę o odpowiedniej wytrzymałosci umieścić w uchwycie przepony, uchwyt nakręcić na wylot lufy,
- wyjałowione elementy strzelby złożyć (patrz rys. 4),
- włożyć uchwyt z makronośnikiem, przykręcić przykrywkę,
- zamknąć drzwiczki aparatu, rozpocząć wytwarzanie próżni w komorze aparatu (przycisk VAC/VENT/HOLD w pozycji VAC), po osiągnięciu żądanej próżni (odczyt na manometrze poniżej panelu kontrolnego) zatrzymać pompę próżniową (przycisk VAC/VENT/HOLD w pozycji HOLD),
- wcisnąć przycisk FIRE, zwolnić go natychmiast po ?strzale?,
- zlikwidować próżnię w komorze aparatu (przycisk VAC/VENT/HOLD w pozycji VENT), gdy ciśnienie wewnątrz strzelby wyrówna się z ciśnieniem atmosferycznym próżni (odczyt na manometrze poniżej panelu kontrolnego), można otworzyć drzwiczki aparatu,
- wyjąć płytkę z ?ostrzelanym? materiałem, zalepić ją paskiem folii lub parafilmu,
Rys. 1. Układ przycisków na panelu kontrolnym strzelby genowej.
Rys. 3. Uchwyt przepony z umieszczoną wewnątrz przeponą. Rys. 2. 1, uchwyt makronośnika; 2, makronośnik; 3, przykrywka; 4,
? układ ładowania?; 5, siatka zatrzymująca; 6, sprężyna dociskająca; 7, uchwyt siatki; 8, pierścienie regulujące odległość siatka: cel; 9, ?półka?; 10, gwintowany cylinder.
d) test histochemiczny GUS,
- do buforu inkubacyjnego dodać 100 m l stock? u X- Gluc/DMSO,
- z każdej płytki wybrać losowo 3- 5 zarodków, inkubować w buforze inkubacyjnym w temp. 37oC przez 12- 24 godz.,Mieszanina rekcyjna:
3 ul DNA do znakowania (150 ng)
7 ul wody
zdenaturować DNA (ogrzać w 100oC przez 10 min., a następnie wstawić do lodu)
dodać pozostałe składniki mieszaniny
3 ul mieszaniny dATP, dGTP, dTTP,
(każdy z nukleotydów w stężeniu 0.5mmol/l),
2 ul mieszaniny heksanukleotydów,
1 ul polimerazy Klenowa (2 U/ul),
5 ul - 50 uCi [a 32P] dCTP, 3000 Ci/mmol
Reakcje prowadzić przez 1 godz. w 37oC
Wyznakowane DNA oddzielić od mieszaniny trifosforanów nukleozydów na kolumience wypełnionej Sephadexem G-50
Uwaga! DEPC jest trujący !
Uwaga! Z RNA należy zawsze pracować w rękawiczkach !- włączyć strzelbę genową (przycisk ON/OFF na panelu kontrolnym) i pompę próżniową,
- otworzyć zawór łączący butlę z helem ze strzelbą genową, ustawić ciśnienie na poziomie o 200 psi wyższym od używanego w procesie transformacji,
- przeponę o odpowiedniej wytrzymałosci umieścić w uchwycie przepony, uchwyt nakręcić na wylot lufy,
- wyjałowione elementy strzelby złożyć (patrz rys. 4),
- włożyć uchwyt z makronośnikiem, przykręcić przykrywkę,
- zamknąć drzwiczki aparatu, rozpocząć wytwarzanie próżni w komorze aparatu (przycisk VAC/VENT/HOLD w pozycji VAC), po osiągnięciu żądanej próżni (odczyt na manometrze poniżej panelu kontrolnego) zatrzymać pompę próżniową (przycisk VAC/VENT/HOLD w pozycji HOLD),
- wcisnąć przycisk FIRE, zwolnić go natychmiast po ?strzale?,
- zlikwidować próżnię w komorze aparatu (przycisk VAC/VENT/HOLD w pozycji VENT), gdy ciśnienie wewnątrz strzelby wyrówna się z ciśnieniem atmosferycznym próżni (odczyt na manometrze poniżej panelu kontrolnego), można otworzyć drzwiczki aparatu,
- wyjąć płytkę z ?ostrzelanym? materiałem, zalepić ją paskiem folii lub parafilmu,
Rys. 1. Układ przycisków na panelu kontrolnym strzelby genowej.
Rys. 3. Uchwyt przepony z umieszczoną wewnątrz przeponą. Rys. 2. 1, uchwyt makronośnika; 2, makronośnik; 3, przykrywka; 4,
? układ ładowania?; 5, siatka zatrzymująca; 6, sprężyna dociskająca; 7, uchwyt siatki; 8, pierścienie regulujące odległość siatka: cel; 9, ?półka?; 10, gwintowany cylinder.
d) test histochemiczny GUS,
- do buforu inkubacyjnego dodać 100 m l stock? u X- Gluc/DMSO,
- z każdej płytki wybrać losowo 3- 5 zarodków, inkubować w buforze inkubacyjnym w temp. 37oC przez 12- 24 godz.,Mieszanina rekcyjna:
3 ul DNA do znakowania (150 ng)
7 ul wody
zdenaturować DNA (ogrzać w 100oC przez 10 min., a następnie wstawić do lodu)
dodać pozostałe składniki mieszaniny
3 ul mieszaniny dATP, dGTP, dTTP,
(każdy z nukleotydów w stężeniu 0.5mmol/l),
2 ul mieszaniny heksanukleotydów,
1 ul polimerazy Klenowa (2 U/ul),
5 ul - 50 uCi [a 32P] dCTP, 3000 Ci/mmol
Reakcje prowadzić przez 1 godz. w 37oC
Wyznakowane DNA oddzielić od mieszaniny trifosforanów nukleozydów na kolumience wypełnionej Sephadexem G-50
Uwaga! DEPC jest trujący !
Uwaga! Z RNA należy zawsze pracować w rękawiczkach !- włączyć strzelbę genową (przycisk ON/OFF na panelu kontrolnym) i pompę próżniową,
- otworzyć zawór łączący butlę z helem ze strzelbą genową, ustawić ciśnienie na poziomie o 200 psi wyższym od używanego w procesie transformacji,
- przeponę o odpowiedniej wytrzymałosci umieścić w uchwycie przepony, uchwyt nakręcić na wylot lufy,
- wyjałowione elementy strzelby złożyć (patrz rys. 4),
- włożyć uchwyt z makronośnikiem, przykręcić przykrywkę,
- zamknąć drzwiczki aparatu, rozpocząć wytwarzanie próżni w komorze aparatu (przycisk VAC/VENT/HOLD w pozycji VAC), po osiągnięciu żądanej próżni (odczyt na manometrze poniżej panelu kontrolnego) zatrzymać pompę próżniową (przycisk VAC/VENT/HOLD w pozycji HOLD),
- wcisnąć przycisk FIRE, zwolnić go natychmiast po ?strzale?,
- zlikwidować próżnię w komorze aparatu (przycisk VAC/VENT/HOLD w pozycji VENT), gdy ciśnienie wewnątrz strzelby wyrówna się z ciśnieniem atmosferycznym próżni (odczyt na manometrze poniżej panelu kontrolnego), można otworzyć drzwiczki aparatu,
- wyjąć płytkę z ?ostrzelanym? materiałem, zalepić ją paskiem folii lub parafilmu,
Rys. 1. Układ przycisków na panelu kontrolnym strzelby genowej.
Rys. 3. Uchwyt przepony z umieszczoną wewnątrz przeponą. Rys. 2. 1, uchwyt makronośnika; 2, makronośnik; 3, przykrywka; 4,
? układ ładowania?; 5, siatka zatrzymująca; 6, sprężyna dociskająca; 7, uchwyt siatki; 8, pierścienie regulujące odległość siatka: cel; 9, ?półka?; 10, gwintowany cylinder.
d) test histochemiczny GUS,
- do buforu inkubacyjnego dodać 100 m l stock? u X- Gluc/DMSO,
- z każdej płytki wybrać losowo 3- 5 zarodków, inkubować w buforze inkubacyjnym w temp. 37oC przez 12- 24 godz.,Mieszanina rekcyjna:
3 ul DNA do znakowania (150 ng)
7 ul wody
zdenaturować DNA (ogrzać w 100oC przez 10 min., a następnie wstawić do lodu)
dodać pozostałe składniki mieszaniny
3 ul mieszaniny dATP, dGTP, dTTP,
(każdy z nukleotydów w stężeniu 0.5mmol/l),
2 ul mieszaniny heksanukleotydów,
1 ul polimerazy Klenowa (2 U/ul),
5 ul - 50 uCi [a 32P] dCTP, 3000 Ci/mmol
Reakcje prowadzić przez 1 godz. w 37oC
Wyznakowane DNA oddzielić od mieszaniny trifosforanów nukleozydów na kolumience wypełnionej Sephadexem G-50
Uwaga! DEPC jest trujący !
Uwaga! Z RNA należy zawsze pracować w rękawiczkach !- włączyć strzelbę genową (przycisk ON/OFF na panelu kontrolnym) i pompę próżniową,
- otworzyć zawór łączący butlę z helem ze strzelbą genową, ustawić ciśnienie na poziomie o 200 psi wyższym od używanego w procesie transformacji,
- przeponę o odpowiedniej wytrzymałosci umieścić w uchwycie przepony, uchwyt nakręcić na wylot lufy,
- wyjałowione elementy strzelby złożyć (patrz rys. 4),
- włożyć uchwyt z makronośnikiem, przykręcić przykrywkę,
- zamknąć drzwiczki aparatu, rozpocząć wytwarzanie próżni w komorze aparatu (przycisk VAC/VENT/HOLD w pozycji VAC), po osiągnięciu żądanej próżni (odczyt na manometrze poniżej panelu kontrolnego) zatrzymać pompę próżniową (przycisk VAC/VENT/HOLD w pozycji HOLD),
- wcisnąć przycisk FIRE, zwolnić go natychmiast po ?strzale?,
- zlikwidować próżnię w komorze aparatu (przycisk VAC/VENT/HOLD w pozycji VENT), gdy ciśnienie wewnątrz strzelby wyrówna się z ciśnieniem atmosferycznym próżni (odczyt na manometrze poniżej panelu kontrolnego), można otworzyć drzwiczki aparatu,
- wyjąć płytkę z ?ostrzelanym? materiałem, zalepić ją paskiem folii lub parafilmu,
Rys. 1. Układ przycisków na panelu kontrolnym strzelby genowej.
Rys. 3. Uchwyt przepony z umieszczoną wewnątrz przeponą. Rys. 2. 1, uchwyt makronośnika; 2, makronośnik; 3, przykrywka; 4,
? układ ładowania?; 5, siatka zatrzymująca; 6, sprężyna dociskająca; 7, uchwyt siatki; 8, pierścienie regulujące odległość siatka: cel; 9, ?półka?; 10, gwintowany cylinder.
d) test histochemiczny GUS,
- do buforu inkubacyjnego dodać 100 m l stock? u X- Gluc/DMSO,
- z każdej płytki wybrać losowo 3- 5 zarodków, inkubować w buforze inkubacyjnym w temp. 37oC przez 12- 24 godz.,Mieszanina rekcyjna:
3 ul DNA do znakowania (150 ng)
7 ul wody
zdenaturować DNA (ogrzać w 100oC przez 10 min., a następnie wstawić do lodu)
dodać pozostałe składniki mieszaniny
3 ul mieszaniny dATP, dGTP, dTTP,
(każdy z nukleotydów w stężeniu 0.5mmol/l),
2 ul mieszaniny heksanukleotydów,
1 ul polimerazy Klenowa (2 U/ul),
5 ul - 50 uCi [a 32P] dCTP, 3000 Ci/mmol
Reakcje prowadzić przez 1 godz. w 37oC
Wyznakowane DNA oddzielić od mieszaniny trifosforanów nukleozydów na kolumience wypełnionej Sephadexem G-50
Uwaga! DEPC jest trujący !
Uwaga! Z RNA należy zawsze pracować w rękawiczkach !- włączyć strzelbę genową (przycisk ON/OFF na panelu kontrolnym) i pompę próżniową,
- otworzyć zawór łączący butlę z helem ze strzelbą genową, ustawić ciśnienie na poziomie o 200 psi wyższym od używanego w procesie transformacji,
- przeponę o odpowiedniej wytrzymałosci umieścić w uchwycie przepony, uchwyt nakręcić na wylot lufy,
- wyjałowione elementy strzelby złożyć (patrz rys. 4),
- włożyć uchwyt z makronośnikiem, przykręcić przykrywkę,
- zamknąć drzwiczki aparatu, rozpocząć wytwarzanie próżni w komorze aparatu (przycisk VAC/VENT/HOLD w pozycji VAC), po osiągnięciu żądanej próżni (odczyt na manometrze poniżej panelu kontrolnego) zatrzymać pompę próżniową (przycisk VAC/VENT/HOLD w pozycji HOLD),
- wcisnąć przycisk FIRE, zwolnić go natychmiast po ?strzale?,
- zlikwidować próżnię w komorze aparatu (przycisk VAC/VENT/HOLD w pozycji VENT), gdy ciśnienie wewnątrz strzelby wyrMieszanina rekcyjna:
3 ul DNA do znakowania (150 ng)
7 ul wody
zdenaturować DNA (ogrzać w 100oC przez 10 min., a następnie wstawić do lodu)
dodać pozostałe składniki mieszaniny
3 ul mieszaniny dATP, dGTP, dTTP,
(każdy z nukleotydów w stężeniu 0.5mmol/l),
2 ul mieszaniny heksanukleotydów,
1 ul polimerazy Klenowa (2 U/ul),
5 ul - 50 uCi [a 32P] dCTP, 3000 Ci/mmol
Reakcje prowadzić przez 1 godz. w 37oC
Wyznakowane DNA oddzielić od mieszaniny trifosforanów nukleozydów na kolumience wypełnionej Sephadexem G-50
Uwaga! DEPC jest trujący !
Uwaga! Z RNA należy zawsze pracować w rękawiczkach !- włączyć strzelbę genową (przycisk ON/OFF na panelu kontrolnym) i pompę próżniową,
- otworzyć zawór łączący butlę z helem ze strzelbą genową, ustawić ciśnienie na poziomie o 200 psi wyższym od używanego w procesie transformacji,
- przeponę o odpowiedniej wytrzymałosci umieścić w uchwycie przepony, uchwyt nakręcić na wylot lufy,
- wyjałowione elementy strzelby złożyć (patrz rys. 4),
- włożyć uchwyt z makronośnikiem, przykręcić przykrywkę,
- zamknąć drzwiczki aparatu, rozpocząć wytwarzanie próżni w komorze aparatu (przycisk VAC/VENT/HOLD w pozycji VAC), po osiągnięciu żądanej próżni (odczyt na manometrze poniżej panelu kontrolnego) zatrzymać pompę próżniową (przycisk VAC/VENT/HOLD w pozycji HOLD),
- wcisnąć przycisk FIRE, zwolnić go natychmiast po ?strzale?,
- zlikwidować próżnię w komorze aparatu (przycisk VAC/VENT/HOLD w pozycji VENT), gdy ciśnienie wewnątrz strzelby wyrówna się z ciśnieniem atmosferycznym próżni (odczyt na manometrze poniżej panelu kontrolnego), można otworzyć drzwiczki aparatu,
- wyjąć płytkę z ?ostrzelanym? materiałem, zalepić ją paskiem folii lub parafilmu,
Rys. 1. Układ przycisków na panelu kontrolnym strzelby genowej.
Rys. 3. Uchwyt przepony z umieszczoną wewnątrz przeponą. Rys. 2. 1, uchwyt makronośnika; 2, makronośnik; 3, przykrywka; 4,
? układ ładowania?; 5, siatka zatrzymująca; 6, sprężyna dociskająca; 7, uchwyt siatki; 8, pierścienie regulujące odległość siatka: cel; 9, ?półka?; 10, gwintowany cylinder.
d) test histochemiczny GUS,
- do buforu inkubacyjnego dodać 100 m l stock? u X- Gluc/DMSO,
- z każdej płytki wybrać losowo 3- 5 zarodków, inkubować w buforze inkubacyjnym w temp. 37oC przez 12- 24 godz.,Mieszanina rekcyjna:
3 ul DNA do znakowania (150 ng)
7 ul wody
zdenaturować DNA (ogrzać w 100oC przez 10 min., a następnie wstawić do lodu)
dodać pozostałe składniki mieszaniny
3 ul mieszaniny dATP, dGTP, dTTP,
(każdy z nukleotydów w stężeniu 0.5mmol/l),
2 ul mieszaniny heksanukleotydów,
1 ul polimerazy Klenowa (2 U/ul),
5 ul - 50 uCi [a 32P] dCTP, 3000 Ci/mmol
Reakcje prowadzić przez 1 godz. w 37oC
Wyznakowane DNA oddzielić od mieszaniny trifosforanów nukleozydów na kolumience wypełnionej Sephadexem G-50
Uwaga! DEPC jest trujący !
Uwaga! Z RNA należy zawsze pracować w rękawiczkach !- włączyć strzelbę genową (przycisk ON/OFF na panelu kontrolnym) i pompę próżniową,
- otworzyć zawór łączący butlę z helem ze strzelbą genową, ustawić ciśnienie na poziomie o 200 psi wyższym od używanego w procesie transformacji,
- przeponę o odpowiedniej wytrzymałosci umieścić w uchwycie przepony, uchwyt nakręcić na wylot lufy,
- wyjałowione elementy strzelby złożyć (patrz rys. 4),
- włożyć uchwyt z makronośnikiem, przykręcić przykrywkę,
- zamknąć drzwiczki aparatu, rozpocząć wytwarzanie próżni w komorze aparatu (przycisk VAC/VENT/HOLD w pozycji VAC), po osiągnięciu żądanej próżni (odczyt na manometrze poniżej panelu kontrolnego) zatrzymać pompę próżniową (przycisk VAC/VENT/HOLD w pozycji HOLD),
- wcisnąć przycisk FIRE, zwolnić go natychmiast po ?strzale?,
- zlikwidować próżnię w komorze aparatu (przycisk VAC/VENT/HOLD w pozycji VENT), gdy ciśnienie wewnątrz strzelby wyrówna się z ciśnieniem atmosferycznym próżni (odczyt na manometrze poniżej panelu kontrolnego), można otworzyć drzwiczki aparatu,
- wyjąć płytkę z ?ostrzelanym? materiałem, zalepić ją paskiem folii lub parafilmu,
Rys. 1. Układ przycisków na panelu kontrolnym strzelby genowej.
Rys. 3. Uchwyt przepony z umieszczoną wewnątrz przeponą. Rys. 2. 1, uchwyt makronośnika; 2, makronośnik; 3, przykrywka; 4,
? układ ładowania?; 5, siatka zatrzymująca; 6, sprężyna dociskająca; 7, uchwyt siatki; 8, pierścienie regulujące odległość siatka: cel; 9, ?półka?; 10, gwintowany cylinder.
d) test histochemiczny GUS,
- do buforu inkubacyjnego dodać 100 m l stock? u X- Gluc/DMSO,
- z każdej płytki wybrać losowo 3- 5 zarodków, inkubować w buforze inkubacyjnym w temp. 37oC przez 12- 24 godz.,ówna się z ciśnieniem atmosferycznym próżni (odczyt na manometrze poniżej panelu kontrolnego), można otworzyć drzwiczki aparatu,
- wyjąć płytkę z ?ostrzelanym? materiałem, zalepić ją paskiem folii lub parafilmu,
Rys. 1. Układ przycisków na panelu kontrolnym strzelby genowej.
Rys. 3. Uchwyt przepony z umieszczoną wewnątrz przeponą. Rys. 2. 1, uchwyt makronośnika; 2, makronośnik; 3, przykrywka; 4,
? układ ładowania?; 5, siatka zatrzymująca; 6, sprężyna dociskająca; 7, uchwyt siatki; 8, pierścienie regulujące odległość siatka: cel; 9, ?półka?; 10, gwintowany cylinder.
d) test histochemiczny GUS,
- do buforu inkubacyjnego dodać 100 m l stock? u X- Gluc/DMSO,
- z każdej płytki wybrać losowo 3- 5 zarodków, inkubować w buforze inkubacyjnym w temp. 37oC przez 12- 24 godz.,żnię w komorze aparatu (przycisk VAC/VENT/HOLD w pozycji VENT), gdy ciśnienie wewnątrz strzelby wyrówna się z ciśnieniem atmosferycznym próżni (odczyt na manometrze poniżej panelu kontrolnego), można otworzyć drzwiczki aparatu,
- wyjąć płytkę z ?ostrzelanym? materiałem, zalepić ją paskiem folii lub parafilmu,
Rys. 1. Układ przycisków na panelu kontrolnym strzelby genowej.
Rys. 3. Uchwyt przepony z umieszczoną wewnątrz przeponą. Rys. 2. 1, uchwyt makronośnika; 2, makronośnik; 3, przykrywka; 4,
? układ ładowania?; 5, siatka zatrzymująca; 6, sprężyna dociskająca; 7, uchwyt siatki; 8, pierścienie regulujące odległość siatka: cel; 9, ?półka?; 10, gwintowany cylinder.
d) test histochemiczny GUS,
- do buforu inkubacyjnego dodać 100 m l stock? u X- Gluc/DMSO,
- z każdej płytki wybrać losowo 3- 5 zarodków, inkubować w buforze inkubacyjnym w temp. 37oC przez 12- 24 godz.,