Przedstawiona metoda umożliwia szybką izolację roślinnego DNA na małą skalę, bez wirowania w gradiencie CsCl. Wyizolowane cząsteczki DNA mają około 50 kb nadają się do różnych celów np. trawienia enzymami restrykcyjnymi, hybrydyzacji Southern. Z jednego grama tkanki roślinnej można uzyskać 50-100 ug DNA. Podana metoda może być stosowana do izolacji DNA z różnych gatunków roślin, np. Nicotiana tabacum, N. plumbaginifolium, N. lyscopericum sp., Arabidopsis thaliana.
Odczynniki i aparatura:
- moYdzierz i tłuczek porcelanowy, probówki wirownicze, probówki typu Corex, probówki Eppendorfa, końcówki do pipet,
- 2xCTAB ( 100mM Tris pH 8.0, 1.4M NaCl, 20mM EDTA pH 8.0, 2% CTAB, 0.2% b -merkaptoetanol), mieszanina chloroform:alkohol izoamylowy (24:1), izopropanol,
roztwór II ( 76% etanol, 10mM octan amonu ), TE pH 7.5 ( 10mM Tris, 1mM EDTA ).
Wykonanie:
- 1 gram tkanki roślinnej zamrozić w ciekłym azocie i utrzeć w możdzierzu,
- dodać 5 ml roztworu 2xCTAB,
- próbki inkubować w 60oC przez 30 minut, w trakcie inkubacji kilkakrotnie mieszać,
- dodać równą objętość mieszaniny chloroform:alkohol izoamylowy (24:1), mieszać łagodnie przez 15 minut,
- mieszaninę przenieść do probówek typu Corex i wirować przy 10000 obrotów/min przez 15 minut w rotorze SS34 (wirówka Sorvall),
- przenieść fazę wodną do nowych probówek, dodać 0.7 objętości zimnego izopropanolu,
(-20oC), mieszać delikatnie aż pojawi się wytrącony DNA,
- przenieść DNA do probówki Eppendorfa, dodać 500 ul roztworu II, pozostawić na 15 min. w lodzie,
- probówki zwirować w mikrowirówce, usunąć roztwór, osad lekko wysuszyć,
- osad zawiesić w TE pH 7.5.
- prowadzić elektroforezę przy napięciu 5V/cm, w buforze TBE, stężenie bromku etydyny powinno wynosić nie więcej niż 0.5 ug/ml.