Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym jest techniką powszechnie stosowaną w analizie białek. W zależności od zastosowanego układu można uzyskać rozdział polipeptydów stosownie do różnych właściwości fizykochemicznych. Przyjmuje się, że elektroforeza w obecności SDS frakcjonuje białka zależnie od ich masy (długości łańcucha polipeptydowego).
Ten typ elektroforezy jest obecnie najczęściej stosowany i może być użyty jako jedna metoda analityczna lub stanowić element szeregu dalszych, bardziej skomplikowanych badań (np. elektroforeza dwuwymiarowa, preparatywna, Western blotting).
Złożem, w którym następuje rozdział białek jest żel poliakrylamidowy, w czasie polimeryzacji oraz w trakcie elektroforezy ustawiony w pozycji pionowej (ang. vertical slab system). Standardowo SDS PAGE jest używana w wersji tzw. disc electrophoresis (ang. discontinuous pH), umożliwiającej maksymalne wykorzystanie zdolności rozdzielczych tej metody. W praktyce ta ?nieciągłość? dotyczy zarówno żelu, który składa się jakby z dwóch warstw, jak również buforu do elektroforezy: innego w górnym, innego w dolnym zbiorniku aparatu do elektroforezy. Próbki nakładane na żel w tym układzie mogą mieć stosunkowo dużą objętość, ponieważ w czasie przechodzenia przez górną warstwę żelu zostają zagęszczone do wąskiego pasma, które w dolnym żelu rozdziela się na pojedyncze, ?ostre? prążki.
W rzeczywistości białka rozdzielane są w SDS PAGE na zasadzie filtracji, analogicznie do metody chromatograficznej sączenia molekularnego.
Ponieważ frakcjonowanie zachodzi w zależności od długości łańcucha polipeptydowego, można ustalić masę danego białka przez porównanie z odpowiednimi standardami. Jest to metoda pozwalająca na oznaczenie masy białka z dokładnością do 5-10%, ale niestety nie każdy polipeptyd można w ten sposób scharakteryzować (jednym z wyjątków są białka histonowe).
Ćwiczenie będzie zawierało następujące elementy:
- krótkie wprowadzenie w techniki elektroforezy białek
- nauka wylewania żelu poliakrylamidowego
- ekstrakcja białek z materiału roślinnego
- prowadzenie elektroforezy w układzie z SDS
- wybarwianie żelu po zakończeniu elektroforezy
Izolacja białek z materiału roślinnego
Metody stosowane przy izolacji i oczyszczaniu białek są bardzo różnorodne i ich wybór zależy od właściwości danego białka. Poniżej podana została procedura pozwalająca na małoselektywną ekstrakcję szeregu białek z liści roślin (tu: tytoniu).
Wykonanie
- ok. 1g liści tytoniu zamrozić w ciekłym azocie i utrzeć w moYdzierzu na proszek
- proszek przenieść do zlewki na 50ml i zalać 6ml buforu 10mM Tris-Cl pH 8
- zawiesinę przenieść do homogenizatora Pottera-Elvehjema i ?homogenizować? kilkukrotnie przesuwając tłoczek
- z roztworu należy pobrać próbki o różnej objętości do naniesienia na żel
Uwaga ! Wszystkie czynności należy wykonywać w temp. 0 do 4OC. Roztwór do homogenizacji powinien zawierać fluorek fenylometylosulfonowy (PMSF) w stęż. 1mM.
Przygotowanie żelu do SDS PAGE
Roztwory potrzebne do przeprowadzenia elektroforezy:
- mieszanina monomerów (30% akrylamid, 0.8% bisakrylamid) przefiltrowana przez filtr 0.45 um; roztwór należy przechowywać w lodówce w ciemnej butelce
Uwaga ! Roztwór akrylamidu jest silną neurotoksyną !
- 1.5M Tris-Cl pH 8.8
- 0.5M Tris-Cl pH 6.8
- 10% SDS
- TEMED
- 10% nadsiarczan amonu (APS)
- bufor do elektroforezy (25mM Tris, 192mM glicyna, 0.1% SDS pH 8.3), przygotowano bufor stężony 5x;
- bufor do próbek (60mM Tris-Cl pH 6.8, 2% SDS, 10% glicerol, 0.025% Bromophenol Blue)
- roztwór do barwienia (0.2% Coomassie Brillant Blue G-250, 40% metanol, 10% kwas octowy)
- roztwór do odbarwiania (10% metanol, 7% kwas octowy)
Wylewanie żelu
Idealnie czyste szyby należy złożyć, umieszczając między nimi przekładki (ang. spacers) o odpowiedniej grubości i uszczelnić zestaw. Szyby powinne być ściśnięte spinaczami..
Aby wylać żel poliakrylamidowy, należy zmieszać składniki w następujących proporcjach:
- dla 12% żelu rozdzielającego:
6ml mieszaniny monomerów
3.6ml 1.5M Tris-Cl pH 8.8
150ul 10% SDS
5.25ml wody
50ul 10% APS
10ul TEMEDu (objętość końcowa ok.15ml)
Zwykle przed dodaniem katalizatorów (APS i TEMED) zaleca się odpowietrzenie mieszaniny. Roztwór APS należy przygotować na świeżo. Katalizatory dodaje się tuż przed wylaniem mieszaniny pomiędzy szyby. Od razu po dodaniu katalizatorów polimeryzacji roztwór należy wymieszać i przy pomocy pipetki nalać między szyby (pamiętając o zostawieniu miejsca na żel zatężający). Na wierzch żelu nałożyć cienką warstwę n-butanolu.
- dla żelu zatężającego:
0.65ml mieszaniny monomerów
1.2ml 0.5M Tris-Cl pH 6.8
120ul 10% SDS
3ml wody
25ul 10% APS
5ul TEMED (objętość końcowa ok. 5ml)
Po spolimeryzowaniu żelu rozdzielającego należy osuszyć jego górną część przy pomocy bibuły, a następnie wylać żel zatężający. Grzebień trzeba umieścić w żelu zatężającym tak, by w studzienkach nie było pęcherzyków powietrza. Żel zostawić na noc.
Przed elektroforezą żel (pomiędzy szybami) umiesza się w aparacie i zalewa buforem elektrodowym. Po ostożnym wyjęciu grzebienia z żelu nie można zapomnieć o przepłukaniu studzienek i ?wygonieniu? pęcherzy powietrza spomiędzy szyb w dolnej części żelu.
Przygotowanie próbek do naniesienia na żel
Wykonanie
- do ponumerowanych probówek Eppendorfa dodać ekstrakt z liści tytoniu, wodę i bufor do próbek w/g schematu:
ekstrakt [ul] woda [ul] bufor [ul] obj.całk. [ul]
1. 2 8 10 20
2. 5 5 10 20
3. 10 - 10 20
4. 20 - 20 40
- do każdej próbki dodać po 1ul 2-merkaptoetanolu
- próbki należy zamieszać i zwirować (5 sekund) w mikrowirówce
- inkubować preparaty przez 4 minuty w 95OC
- nanieść próbki na żel i rozpocząć elektroforezę
W razie potrzeby w analogiczny sposób można przygotować próbkę ze standardem wielkości białek.
Elektroforeza
Warunki natężenia i napięcia, przy których prowadzona jest elektroforeza, są zależne od grubości i długości żelu oraz naszych oczekiwań co do jakości i czasu rozdziału białek.
Zwykle zalecane jest stałe natężenie prądu w granicach 12-30 mA / 1mm grubości żelu.
Barwienie prążków na żelu
Spośród wielu metod barwienia białek po SDS PAGE wybrano najpowszechniej stosowaną (choć nie najczulszą) metodę barwienia Coomassie Brillant Blue.
Wykonanie
- po zakończeniu elektroforezy należy rozmontować aparat i delikatnie rozdzielić szyby
- żel umieścić w roztworze barwnika i zostawić na kołysce laboratoryjnej na 0.5 do 1 godziny
- po tym czasie zlać barwnik do butelki (może być używany wielokrotnie) i żel inkubować w roztworze odbarwiającym aż do uzyskania prawie przezroczystego tła i wyraYnych prążków białek
- żel po odbarwieniu może być długo przechowywany w roztworze 7% kwasu octowego
Należy pamiętać o tym, że jakość rozdziału w SDS PAGE zależy od poprawnego i solidnego wykonania szeregu prostych czynności. Dlatego też mimo, iż technika nie jest skomplikowana, może zajmować sporo czasu, kilkakrotnie więcej niż elektroforeza agarozowa służąca do rozdziału preparatów DNA.