Elektroforeza w żelu

Technika ta służy do rozdziału molekuł na podstawie ich wielkości. Właściwości użytego do elektroforezy buforu i jego pH są dobrane, tak że rozdzielane molekuły mają ujemny wypadkowy ładunek elektryczny. RNA przemieszcza się w polu elektrycznym od negatywnej elektrody (-) do dodatniej elektrody (+) i przeciskając się przez pory żelu rozdziela się pod względem wielkości. Aby zapobiec różnicą wielkości struktur drugorzędowych tworzonych przez RNA należy go zdenaturować. Różne techniki są stosowane przy usuwaniu struktur drugorzędowych i trzeciorzędowych RNA i DNA (np. podczas przygotowywanie DNA do Southerna tnie się go enzymem restrykcyjnym na fragmenty restrykcyjne mające tylko strukturę pierwszorzędową). RNA do Northerna mimo, że RNA jest jednoniciowe to poprzez parowanie komplementarnych zasad tworzy struktury drugorzędowe (zwykle mniej niż 50% cząsteczki RNA pozostaje jednoniciowa). Aby temu zapobiec denaturujemy RNA w obecności formaldehydu.

Pozbawione struktur drugorzedowych próbki rozdzieliają się pod względem masy cząsteczkowej, ponieważ bez struktur drugorzędowych i trzeciorzędowych ich jest proporcjonalna do masy cząsteczkowej. Odległość na jaką się przemieszczą jest proporcjonalna w przybliżeniu do log odwrotności masy cząsteczkowej (logarytm 1/MW).

Masa molekularna rozdzielanych cząsteczek mierzona jest w:

DNA:

bp (parach zasad) i kbp (1kbp=1000bp)

RNA:

nt (nucleotydach) i knt

W większości elektroforez do jednej studzienki dodaje się mieszaninę DNA lub RNA lub białka o znanej masie cząsteczkowej. Tego rodzaju standardy wielkości (masy cząsteczkowej) używane są do kalibracji danej elektroforezy (umożliwiają określenie wielkości naszych molekuł poprzez porównanie ze standardami, bo ``masa naszej molekuły'' = ``masa molekuły standardu który przemieścił się o ten sam dystans w trakcie elektroforezy''). Próbki na żelu wybarwia się bromkiem etydyny który wiąże się w sposób niespecyficzny (niezależny od sekwencji) z naszymi RNA (zauważ, że sonda wiąże się ale w sposób zależny od sekwencji). Kompleks DNA-EtBr fluoryzuje w świetle ultrafioletowym.