Przygotowanie sondy

Radioaktywne sondy DNA dla hybrydyzacji Southern i Northern

Naszym celem jest w tym wypadku stworzenie radioaktywnej kopii dwuniciowego fragmentu DNA. Do tej procedury używa się wycięty z plazmidu fragment restrykcyjny zawierający nasz gen.

Tak więc, trawimy plazmid odpowiednim enzymem restrykcyjnym, a produkty trawienia rozdzielamy na żelu. Ponieważ plazmid ma zwykle mniej niż 20 kbp i znamy jego mapę restrykcyjną, więc jesteśmy w stanie zidentyfikować prążek na żelu zawierający interesującą nas sekwencję. Ten prążek wycinamy z żelu i ekstrahujemy z niego DNA. Ponieważ prążki są dobrze od siebie oddzielone na żelu DNA jakie z nich wyizolowaliśmy zawiera identyczne fragmenty dwuniciowego DNA.

Fragmenty restrykcyjne (matryca) są następnie znakowane z użyciem losowych heksamerów ("random hexamer"):

1. Denaturujemy matrycowe DNA - helisy rozdzielamy przez gotowanie.
2. Dodajemy mieszaninę losowych heksamerów (6-cio nukleotydowe fragmenty ssDNA) o sekwencjach zawierających wszystkie kombinacje 6 nukleotydów. Te heksamery parują ze wszystkimi komplementarnymi miejscami na matrycy.
3. Dodajemy: DNA polimerazę, dATP, dGTP, dTTP i radioaktywne dCTP. Zazwyczaj, fosforan związany z cukrem (fosforan a jest włączany do nici DNA) jest radioaktywnym izotopem (fosfor-32).
4. Mieszaninę reakcyjną gotujemy przed hybrydyzacją aby zdenaturować zsyntetyzowaną sondę.
5. W ten sposób otrzymujemy radioaktywny jednoniciowy DNA, który jest kopią obydwu nici matrycy i nadaje się do użycia jako sonda

Ta procedura jest przedstawiona na schemacie poniżej (wyznakowane DNA jest narysowane grubszą linią).