Na tym etapie, na powierzchni filtra znajdują się molekuły rozdzielonego pod względem wielkości RNA oraz miejsca które jeszcze nie związały (niespecyficznie) żadnych molekuł. Gdybyśmy dodali sondę do takiego filtra, to związała by się ona niespecyficznie do wolnych miejsc na filtrze, tak jak to zrobiły molekuły transferowane z żelu na filtr. Otrzymalibyśmy filtr całkowicie pokryty sondą tak, że detekcja hybryd sonda-RNA nie byłaby możliwa. Z tego powodu filtry przed hybrydyzacją inkubuje się w roztworze zawierającym stężony DNA lub RNA blokujący niespecyficznie wiążące miejsca. Takie traktowanie opłaszcza filtr i zapobiega niespecyficznemu wiązaniu się sondy z powierzchnią filtra.