Znakowanie sondy

Uwaga. Wszystkie czynności z izotopem przeprowadzamy w pokoju izotopowym. Eppendorfówki z izotopem trzymamy w statywach z pleksi, cały czas nosimy fartuch i dwie pary rękawiczek gumowych (zewnętrzną parę jeśli się zabrudzi izotopem zastępujemy nowymi rekawiczkami, eppendorfówki przenosimy pęsetą (nie ręką), wszystko robimy za ekranami z pleksi ). Przestrzegamy wszystkich zasad pracy z izotopem w pracowni izotopowej klasy III.

Zmodyfikowana metoda z kitu Fermentasa

Zmieszaj:

• 5ul DNA (150ng - taki prążek już wyraźnie widać na żelu)
• 5ul primerów (hexanukleotydów)
• 10ul H2O

Zwiruj przez kilka sekund, Denaturuj (gotowanie) przez 5-10 min, gwałtownie schłódź na lodzie i zwiruj przez kilka sekund.

Dodaj:

• 1,5 ul MixA (bez dATP)
• 1,5ul H2O
• 1,5ul polimerazy Klenowa
• Na końcu tuż po dodaniu Klenowa dodaj przestrzegając BHP izotop 32P[dATP]

Wymieszaj i zwiruj przez kilka sekund, inkubacja prze 10 minut w 37oC (w ogrzanym wcześniej statywie z pleksi).

Dodaj:

• 3ul dNTP i inkubuj przez 5 min. w 37oC

Zatrzymaj reakcję przez dodanie 1ul 0,5M EDTA (pH 8). Tak wyznakowaną sondę oczyszcza się na kolumnie z Sephadex G-50