Oczyszczanie wyznakowanej sondy

Sondę odczyszczamy, aby pozbyć się niewłączonego do DNA izotopu i zbyt krótkich radioaktywnych fragmentów, które mogłyby wiązać się niespecyficznie do membrany. Wszystkie rzeczy niezbędne podczas oczyszczania sondy muszą zostać przygotowane i poustawiane wcześniej.

1. Do strzykawki (mała cieniutka strzykawka "insulinówka") wkładamy na dno (przy wylocie do igły) kawałek waty szklanej. Tłoczek odkładamy na bok (będzie potrzebny później).
2. Tak zatkaną strzykawkę po umocowaniu w statywie, napełniamy małymi kroplami zawiesiną Sephadex'u G-50 w buforze TE. Sephadex powinien osiąść w strzykawce tak, aby pozostało około 1-2 cm pustego miejsca od góry strzykawki.
3. Pod strzykawkę wstawiamy statyw litego pleksi a w nim kilka eppendorfówek. Całość stawiamy za ekranem ochronnym z pleksi.
4. Obok strzykawki stawiamy małą płytkę z pleksi ze szczeliną. Płytka ta posłuży nam do sprawdzania radioaktywności na różnych poziomach strzykawki (promieniowanie przechodzi tylko przez szczelinę (najlepiej ustawić płytkę tak, aby do licznika docierało tylko promieniowanie z dolnego końca strzykawki).
5. Nanosimy radioaktywną sondę (z dodatkiem kilkunastu ul blue dextran'u) na sephadex w strzykawce i po wsiąknięciu tego roztworu w sephadex, dodajemy małymi porcjami roztwór TE. Po dodaniu pierwszej porcji TE powinniśmy poczekać aż wsiąknie ona całkowicie w sephadex.
6. Przepływ dodawanego TE przez sephadex powoduje, że duże cząsteczki DNA szybko się przemieszczają wraz z jego strumieniem a małe wolniej. Powoduje to rozdzielenie dużych cząsteczek DNA od małych i od niewłączonego do DNA izotopu. Z chwilą, gdy duże cząsteczki wyznakowanego DNA znajdą się u wylotu strzykawki, licznik G-M zarejestruję zwiększoną liczbę rozpadów radioaktywnych. W tym momencie trzeba przesunąć statyw z eppendorfówkami tak aby wypływający ze strzykawki roztwór zbierał się do nowej probówki. W zależności od wielkości wyznakowanych fragmentów kolokalizują się one w roztworze zabarwionym blue dextranem.
7. Z chwilą gdy zaczyna spadać ilość zliczeń na liczniku G-M, przesuwamy statyw i wypływający roztwór zbieramy do nowej probówki aż do momentu w którym ilość zliczeń zacznie rosnąć (jeśli w ogóle taki moment nastąpi).
8. Następnie tłoczkiem od strzykawki zatykamy ją od góry (uwaga na wypływające ze strzykawki krople) i wyrzucamy ją do kosza na odpadki radioaktywne.

Nasza wyznakowana sonda znajduje się w pierwszej (a czasami także w drugiej) najbardziej radioaktywnej probówce. Radioaktywność probówek sprawdzamy wyciągając je pęsetą na chwile ze statywu. Należy to robić w tej samej odległości od licznika (np. 30cm). Zawsze najlepiej osłonięta od promieniowania powinna być osoba pracująca z izotopem.