Next: Składanie nukleosomów w chromatynie Up: Kowalencyjne modyfikacje histonów Previous: Metylacja histonów   Spis rzeczy

Fosforylacja histonów

Fosforylacji ulegają zarówno histony rdzeniowe, jak i łącznikowe. W przypadku histonów łącznikowych H1 i histonu H3 grupa fosforanowa zostaje przyłączona do reszt serynowych i treoninowych  tych białek w sposób zależny od fazy cyklu komórkowego (patrz dalej), przy czym jej najwyższy poziom przypada na fazę mitozy. W histonie H1 fosforylacji ulegają reszty Ser/Thr położone w obrębie ogonów N- i C-końcowych (Rys. 7), podczas gdy fosforylacja tych reszt w histonie H3 ogranicza się do ogona N-końcowego (van Holde, 1989).

Co więcej, fosforylacja histonu H3 ogranicza się wyłącznie do stadium mitozy i jest niezbędnym warunkiem prawidłowej kondensacji i segregacji chromosomów w metafazie (Wei i wsp., 1999). Dowodu na taką rolę odwracalnej fosforylacji histonu H3 dostarczyły badania na makronukleusie Tetrahymena, w których doświadczalna zamiana seryny-10, podlegającej modyfikacji, na alaninę, prowadzi do zaburzeń kondensacji chromosomów mitotycznych i mejotycznych. Inne prace, przeprowadzone z wykorzystaniem modelu komórek mysich (Cobb i wsp., 1999) wskazują jednak, że fosforylacja histonu H3 nie może być wyłącznym czynnikiem wywołującym kondensację chromosomów w metafazie.

Obecnie uważa się, że fosforylacja histonów, podobnie jak acetylacja, powoduje rozluźnienie struktury chromatyny: i tak na przykład w mysich fibroblastach poddanych stymulacji czynnikami wzrostowymi i estrami forbolu histon H3 podlega szybkiej fosforylacji jednocześnie z aktywacją transkrypcyjną genów wczesnej odpowiedzi c-fos i c-jun. Ustalono, że ufosforylowana forma histonu wiąże się z uaktywnionymi formami tych genów (Mahadevan i wsp., 1991; Chadee i wsp., 1999).

Związek fosforylacji histonu H1 z cyklem komórkowym i stanem struktury chromatyny był od wielu już lat przedmiotem intensywnych badań. Nasilona fosforylacja histonu H1 podczas mitozy skłoniła niektórych badaczy do postawienia tezy, że modyfikacja ta jest czynnikiem inicjującym proces kondensacji chromosomów (Bradbury i wsp., 1973), a tym samym impulsem wywołującym podziały mitotyczne (Bradbury i wsp., 1974). Wykorzystanie do badań zwierzęcych linii komórkowych poddających się procesowi synchronizacji pozwoliło na ustalenie, że liczba grup fosforanowych przyłączanych początkowo do reszt serynowych w C-końcowej, a następnie do reszt treoninowych w aminowej części histonu łącznikowego zmienia się wraz fazą cyklu w ten sposób, że osiąga maksimum podczas metafazy mitotycznej (Hohman i wsp., 1976): podczas gdy na cząsteczkę histonu H1 w interfazie przypadają 1 3 grupy fosforanowe, w czasie mitozy (począwszy od jej najwcześniejszego stadium profazy, aż do ostatniego telofazy) przypada ich już od 3 do 6, czemu odpowiada zmiana struktury (kondensacja) chromatyny widoczna pod mikroskopem elektronowym (Gurley i wsp., 1978). Ważną cechą modyfikacji histonu H1 przez fosforylację jest jej zróżnicowany zakres w stosunku do kolejnych wariantów sekwencyjnych (izotypów) histonów łącznikowych obecnych w danym rodzaju komórek lub organizmów. Na przykład ludzka linia komórkowe HeLa posiada dwie główne subfakcje histonów H1: H1A i H1B (Ajiro i wsp., 1981a). Występują one w podobnych ilościach, lecz ich poziom fosforylacji różni się znacznie w trakcie całego cyklu komórkowego, nie tylko zaś w trakcie mitozy. Fosforylacja histonu H1B jest niemal dwukrotnie mocniejsza niż wariantu H1A i zachodzi w części aminowej białka w trakcie całego cyklu komórkowego, podczas gdy w białku H1A region ten ulega

fosforylacji wyłącznie w czasie mitozy. Dokładniejsze badania tego zjawiska pozwoliły na ustalenie, że oba warianty histonu łącznikowego zajmują różne, nieprzypadkowe miejsca w chromatynie, i że różnią się także liczbą miejsc podatnych na fosforylację zależną od replikacji DNA (Ajiro i wsp., 1981b). Także sześć wariantów sekwencyjnych histonu H1 myszy podlega zróżnicowanej modyfikacji fosforylacyjnej w kolejnych fazach cyklu komórkowego. I tak, podczas gdy wariant H1b przyłącza w późnej fazie S trzy grupy fosforanowe, a w fazie M pięć, do histonu H1\( ^{o} \) przyłącza się ich w fazie S tylko jedna, a w fazie M - trzy (Talasz i wsp., 1996). Inne prace wykorzystujące przeciwciała specyficzne względem ufosforylowanych i zdefosforylowanych izoform H1 dowodzą, że odmienne fosfoformy histonu H1 zajmują odrębne domeny chromatynowe. I tak w makronukleusie Tetrahymena ufosforylowany histon H1 występuje na skraju ciałek chromatynowych i w otaczającej je euchromatynie, zaś histon H1 pozbawiony grup fosforanowych jest obecny w elektronowo gęstej heterochromatynie (Lu i wsp., 1995).

Głównym akceptorem grup fosforanowych w cząsteczkach histonu H1 pochodzących ze zwierzęcych komórek interfazowych jest ogon aminowy, w którym lokuje się blisko 60% wbudowywanych grup fosforanowych (Hohman, 1983). Z inną sytuacją mamy do czynienia w przypadku niższych eukariontów, takich jak śluzowiec Physarum polycephalum, w którego histonie H1 główne miejsca fosforylacji znajdują się we większej, C-końcowej części cząsteczki (Jerzmanowski i Maleszewski, 1985). Co więcej, fosforylacja histonów łącznikowych w niższych eukariontów wydaje się być znacznie bardziej intensywna i trwała histon H1 Physarum jest zdolny do przyjęcia podczas mitozy aż 20 grup fosforanowych, z których od ośmiu do szesnastu pozostaje przyłączone do cząsteczki H1 również w fazie G2.

Interesujący wydaje się być przypadek histonu H1 u Drosophila: stwierdzono, że istnieje związek pomiędzy bardzo obniżoną fosforylacją histonów H1 i H2A z chromatyny jej chromosomów politenicznych (w porównaniu z diploidalną chromatyną zarodkową), a znacznym spadkiem zawartości gęstej, nieaktywnej traskrypcyjnie heterochromatyny (Holmgren i wsp., 1985). Ponadto przedstawiono dowody, że fosforylacja histonu H1 Drosophila jest stała i niezależna od replikacji DNA, cyklu komórkowego, ani przejściowej stymulacji hormonalnej (Talmange i Blumenfeld, 1987). Dodatkowo, modyfikacja ta zachodzi w obrębie globularnego fragmentu cząsteczki, chociaż dochodzi do niej również w trzech innych miejscach położonych na końcu aminowym.

Dążąc do ustalenia związku fosforylacji histonu H1 i mitotycznej kondensacji chromosomów poddawano komórki bodźcom termicznym i działaniu inhibitorów enzymatycznych. Podniesienie temperatury hodowli komórek FM3A ponad dopuszczalną dla nich granicę zmniejsza fosforylację histonu H1 i wywołuje nienormalną kondensację chromatyny; również w komórkach tsBN2 poddanych działaniu niefizjologicznej temperatury dochodzi na hiperfosforylacji histonu H1 i do przedwczesnej kondensacji chromatyny (ang. premature chromatin condensation, PCC) (Matsumoto i wsp., 1980; Ajiro i wsp., 1983). Także defosforylacja

histonu H1 przy pomocy inhibitora topoizomerazy II, VM26 (Roberge, 1990), lub inhibitora kinazy białkowej, staurosporyny (Thng i wsp., 1994) prowadzi do dekondensacji chromatyny, co mogłoby wskazywać na rolę pełnioną przez H1 w wywołaniu tego procesu. Jednakże wiadomo, że doświadczenia z użyciem podobnych inhibitorów o szerokim spektrum działania obciążone jest potencjalnym niebezpieczeństwem wystąpienia efektów plejotropowych (Dou i wsp., 1999, patrz dalszy ciąg tego podrozdziału).

Głównym enzymem odpowiedzialnym za fosforylację białek jądrowych i wpływających na cykl komórkowy u eukariontów jest kinaza histonu H1 o masie 34 kDa (Woodford i Pardee, 1986), zidentyfikowana początkowo jako produkt genu cdc2+ Schizosaccharomyces pombe (Beach i wsp., 1982; Lohka, 1989). Kinaza cdc2 jest strukturalnym i funkcjonalnym homologiem czynnika wywołującego dojrzewanie (ang. maturation promoting factor, MPF), zdolnego do bezpośredniego wywołania mitozy w oocytach z pominięciem wymogu przejścia fazy syntezy białek komórkowych (Dunphy i wsp., 1988). Do tej pory udało się wykryć obecność homologów kinazy p34cdc2 we wszystkich badanych układach eukariotycznych, wliczając w to ludzkie linie komórkowe (Lee i Nurse., 1988; Lohka, 1989). Świadczy to o konserwowanym charakterze tej modyfikacji białek komórkowych. W wielu różnych typach komórek podlegającym podziałom, p34cdc2 ulega przejściowemu pobudzeniu w trakcie przejścia z fazy G2 cyklu komórkowego w stadium mitozy (Arion i wsp., 1988; Lamb i wsp., 1990). Poziom kinazy p34cdc2 pozostaje stały podczas cyklu komórkowego, lecz jego aktywność podlega wahaniom, wynikającym z oddziaływania MPF z cyklinami - grupą białek, które charakteryzuje synteza i degradacja zależna od fazy cyklu komórkowego (Evans i wsp., 1983; Solomon i wsp., 1988; Murray i wsp., 1989). Cykliny (a w szczególności cyklina B) wiążą się do p34cdc2 i są zdolne do jego pośredniej i bezpośredniej kontroli (Draetta i wsp., 1989; Evans i wsp., 1983; Murray i wsp., 1989; Freeman i Donoghue, 1991).

Zanim histon H1 może zostać zmodyfikowany przez kinazę p34cdc2 (MPF) konieczne jest jego częściowe odłączenie od chromatyny (Jerzmanowski i Cole, 1992). Za proces takiego odłączenia mogą w warunkach fizjologicznych odpowiadać inne białka jądrowe, takie jak HMG, nukloplazmina lub topoizomeraza II, uczestnicząca bezpośrednio w kondensacji chromosomów (Adachi i wsp., 1991; Roth i Allis, 1992).

Kinaza p34cdc2 rozpoznaje najczęściej w białkach sekwencję (S/T)-P-X-(R/K) (seryna lub treonina prolina - aminokwas polarny - (arginina-lizyna, lub inny aminokwas zasadowy), modyfikując ją podczas mitozy (Kennelly i Krebs, 1991). Stwierdzono, że modyfikacja taka zdolna jest do zmniejszenia powinowactwa do DNA peptydów zawierających motyw SPKK pochodzących z histonów H1 i H2B występujących u jeżowca Strongylocentrotus purpuratus specyficznie w jądrach, zaś ich defosforylacja to powinowactwo zwiększa. Tym samym, wiązanie zdefosforylowanych domen SPKK do DNA łącznikowego sprzyja ścisłemu pakowaniu chromatyny plemników  poprzez zbliżenie do siebie sąsiadujących nukleosomów (Green i wsp., 1993). Aktywność tej samej kinazy w procesie fosforylacji histonu H1 wykryto również w amitotycznych makronukleusach Tetrahymena (Roth i wsp., 1991), chociaż dzielą się one bez mitotycznej kondensacji chromosomów. Obserwacja ta podważyła związek pomiędzy fosforylacją histonu H1, a tworzeniem w trakcie podziałów komórkowych skondensowanej struktury chromatyny. Co więcej, ustalono, że również u jeżowca histon H1 obecny jest w silnie skondensowanej chromatynie plemników w postaci zdefosforylowanej (Green i Poccia, 1985).

Ostatnio Dou i współpracownicy (1999) przeprowadzili doświadczenie na Tetrahymena, polegające na wymianie w cząsteczce H1 wszystkich pięciu aminokwasów ulegających fosforylacji (seryn i treonin) na alaniny (otrzymując histon H1 niezdolny do podlegania fosforylacji) albo na reszty kwasu glutaminowego (co odpowiada trwale fosforylowanemu histonowi H1). Nie stwierdzono istotnych różnic w ogólnym fenotypie komórek Tetrahymena zawierających zmutowane cząsteczki histonu H1, chociaż druga mutacja wywierała efekt przypominający ten, jaki daje usunięcie histonu H1 w stosunku do aktywacji genu ngoA, oraz do represji innego genu, (którego funkcja nie jest znana) - CyP1. Z drugiej strony brak fosforylacji H1 w pierwszym mutancie powodował skrócenie czasu niezbędnego do pobudzenia ekspresji genu CyP1. Co więcej, ekspresja CyP1 w dzikich komórkach zachodzi wyłącznie po defosforylacji histonu H1. Taka obserwacja zestawiona z omówionymi poprzednio sprzecznymi danymi na temat związku fosforylacji histonu H1 ze strukturą chromatyny sugeruje, że fosforylacja H1 może być raczej specyficznym regulatorem ekspresji genów in vivo, zaś jej mechanizm może polegać na wydajnym odłączaniu histonu H1.


Next: Składanie nukleosomów w chromatynie Up: Kowalencyjne modyfikacje histonów Previous: Metylacja histonów   Spis rzeczy
Tomasz Calikowski 2000-06-15