Spis rzeczy

Hodowla zawiesiny komórkowej BY-2

Zawiesinę komórkową hodowano zgodnie z procedurą opisaną przez Nagatę i współpracowników (1992). Komórki przesiewano regularnie po 7 dniach hodowli w temperaturze 27C, w ciemności i z intensywnym mieszaniem (150 obrotów na minutę). Procedura przesiewania (pasażowania) komórek przebiegała w ten sposób, że do 50 mililitrów świeżej, ogrzanej do temperatury pokojowej pożywki MS-BY-2 dodawano 3 mililitry tygodniowej zawiesiny BY-2, oraz jeśli wynikało to z genotypu przesiewanej linii komórkowej  odpowiedni antybiotyk selekcyjny lub inhibitor cyklu komórkowego. W celu zabezpieczenia ciągłości linii komórkowych utrzymywane w zawiesinie linie były wysiewane regularnie na podłoże stałe MS-BY-2, gdzie w ciągu ok. 10 dni tworzyły przerastające, nieregularne, żółtawe i miękkie grudki pseudokallusów. Komórki rosnące na podłożu stałym hodowane były w identycznych warunkach, jak te w zawiesinie, choć bez mieszania. W celu ustalenia poziomu żywotności linii komórkowych utrzymywanych w zawiesinie wykonywano test redukcji bezbarwnego chlorku 2,3,5-trifenylotetrazoliowego (TTC, Sigma) do czerwonego, nierozpuszczalnego w wodzie formazanu, w wyniku działania dehydrogenazy lub mitochondrialnego łańcucha oddechowego, występujących wyłącznie w komórkach żywych (Duncan i Widholm, 1990). Do reakcji używano 0,5% roztwór odczynnika, rozpuszczonego w buforze fosforanowym (0,05M KHPO,, 0,05M KHPO4, pH 7,5), mieszano go z odsączoną zawiesiną komórek i pozostawiano na okres od pół godziny do trzech godzin w ciemności. Po tym czasie obserwowano powstawanie czerwonego zabarwienia w komórkach żywych, licząc je pod mikroskopem świetlnym.

  Spis rzeczy