Next: Izolacja plazmidowego DNA bakterii Up: Przygotowanie bakterii kompetentnych Escherichia Previous: Przygotowanie bakterii kompetentnych Escherichia   Spis rzeczy

Otrzymywanie kompetentnych bakterii Agrobacterium tumefaciens i ich transformacja poprzez elektroporację

Nocną hodowlę bakterii w pożywce YEB (hodowla z dodatkiem rifampicyny o stężeniu końcowym 25 \( mu \)g/ml) zwirowywano przez 10 minut w 4\( ^{o} \)C przy 5000 obrotów na minutę (rotor SS34 Sorvall). Osad bakteryjny przepłukiwano w 20 ml sterylnej lodowatej wody zwirowując bakterie w takich samych warunkach jak podano wyżej; płukanie powtarzano 4 razy. Osad bakterii zawieszano w 1 ml sterylnej lodowatej wody bidestylowanej po czym przenoszono 100 \( mu \)l tak przygotowanych bakterii do schłodzonej kuwety do elektroporacji, zawierającej 500 ng plazmidowego DNA. Elektroporację prowadzono przy następujących parametrach: 200 ?, 25 ?F, 2,5 KV. Tuż po przeprowadzeniu elektroporacji do kuwet dodawano 400 ?l pożywki YEB, inkubowano 2 godziny w 28\( ^{o} \)C i wysiewano na szalki YEB rif25 kan50. Hodowlę na szalkach prowadzono przez 48 godzin w temperaturze 28\( ^{o} \)C.



Tomasz Calikowski 2000-06-15