Spis rzeczy

Otrzymywanie kompetentnych bakterii Agrobacterium tumefaciens i ich transformacja poprzez elektroporację

Nocną hodowlę bakterii w pożywce YEB (hodowla z dodatkiem rifampicyny o stężeniu końcowym 25 g/ml) zwirowywano przez 10 minut w 4C przy 5000 obrotów na minutę (rotor SS34 Sorvall). Osad bakteryjny przepłukiwano w 20 ml sterylnej lodowatej wody zwirowując bakterie w takich samych warunkach jak podano wyżej; płukanie powtarzano 4 razy. Osad bakterii zawieszano w 1 ml sterylnej lodowatej wody bidestylowanej po czym przenoszono 100 l tak przygotowanych bakterii do schłodzonej kuwety do elektroporacji, zawierającej 500 ng plazmidowego DNA. Elektroporację prowadzono przy następujących parametrach: 200 ?, 25 ?F, 2,5 KV. Tuż po przeprowadzeniu elektroporacji do kuwet dodawano 400 ?l pożywki YEB, inkubowano 2 godziny w 28C i wysiewano na szalki YEB rif25 kan50. Hodowlę na szalkach prowadzono przez 48 godzin w temperaturze 28C.