Spis rzeczy

Elektroforeza białek w żelu poliakrylamidowym z dodatkiem SDS

Próbki białek po zagęszczaniu w wirówce próżniowej pozostawiane były w niewielkiej objętości roztworu (około 100 ?l). Rozdział białek w żelu poliakrylamidowym z dodatkiem SDS prowadzony był zgodnie z opisem Laemmliego (1970). Do próbek (ok. 10 15 ?l) dodawano równą objętość buforu do próbek (0,06 M TrisHCl pH 6,8, 2 % SDS, 10 % glicerol, 0,015 % błękit bromofenolowy); do każdego preparatu dodawano 1 ?l ?-merkaptoetanolu, po czym próbki krótko zwirowywano i inkubowano przez 4 minuty w temperaturze 95C. Rozdział prowadzono w nieciągłym żelu poliakrylamidowym; zwykle (o ile nie podano inaczej) stosowano żel o stężeniu 12 % o następującym składzie: żel rozdzielający (objętości składników dla całkowitej objętości 15 ml) 6 ml stężonej mieszaniny monomerów (30% akrylamid:0,8% bisakrylamid), 3,6 ml 1,5 M TrisHCl pH 8,8, 150 l 10% SDS, 5,25 ml H2O, 50 ?l 10% (w/v) nadsiarczanu amonu (APS), 10 l N, N, N, N-tetrametylodietylenoaminy (TEMED, Sigma), żel zatężający (objętości składników dla całkowitej objętości 5 ml) 0,65 ml stężonej mieszaniny monomerów (30 % akrylamid : 0,8 % bisakrylamid), 1,2 ml 0,5 M TrisHCl pH 6,8, 120 ?l 10% SDS, 3 ml H2O, 25 ?l 10% APS, 5 l TEMED. Elektroforezę prowadzono w buforze zawierającym 25 mM Tris-HCl, 192 mM glicynę i 0,1% SDS, aż do osiągnięcia dolnej krawędzi szyb przez migrujący błękit bromofenolowy przy stałym natężeniu 15 mA (dla żelu o grubości 0,75 mm). Po zakończeniu elektroforezy żel barwiono w roztworze barwiącym (0,2% barwnik Coomasie Brilliant Blue G-250, 40% metanol, 10% kwas octowy) przez 2-10 godzin na kołysce laboratoryjnej, a następnie odbarwiano w roztworze 10% metanolu aż do odpłukania się barwnika z żelu.

  Spis rzeczy