Spis rzeczy

Transformacja krążków liściowych tytoniu

30 l hodowli nocnej bakterii Agrobacterium (pożywka YEB z dodatkiem odpowiednich antybiotyków) zaszczepiano w 30 ml świeżej pożywki YEB, dodawano rifampicynę (do stężenia końcowego 25 g/ml) i kanamycynę (stężenie końcowe 100 g/ml) i hodowano przez noc w temperaturze 28C. Bakterie odwirowywano 10 minut przy 5000 rpm (4C), osad bakterii zawieszano w 10 ml 0,2 M CaCl po czym płukanie powtarzano jeszcze raz. Bakterie zawieszano w 10 ml 0,2 M CaCl . Do każdej transformacji tytoniu wykorzystywano 3 średniej wielkości młode liście roślin tytoniu linii SR1, hodowanych w warunkach sterylnych. Liście odcinano, wykładano na szalkę Petriego, zwilżano płynną pożywką MS, usuwano główne nerwy, a pozostałą część liścia cięto na fragmenty o wielkości około 0,5 cm2. Fragmenty liści zalewano uprzednio przygotowanymi bakteriami i pozostawiano na nowej szalce na 30 minut. Po tym czasie eksplantaty  osuszano na sterylnej bibule i wykładano na pożywkę stałą MST, na której kokultywację prowadzono przez 5 dni w 26C (fotoperiod 16h). Po upływie tego czasu eksplantaty przenoszono na nowe podłoże MST z dodatkiem antybiotyków (claforan hamujący wzrost Agrobacterium o stężeniu 500 mg/l, kanamycyna jako antybiotyk selekcyjny 100 mg/l) i prowadzono hodowlę w warunkach podanych uprzednio przenosząc eksplantaty na nowe podłoże co 10 dni. Regenerujące pędy odcinano od kalusa i umieszczano w podłożu stałym MS z dodatkiem antybiotyku selekcyjnego (kanamycyny  o stężeniu podanym uprzednio). Po ukorzenieniu roślinki przenoszono do doniczek z ziemią i hodowano w warunkach niesterylnych w szklarni.

  Spis rzeczy