Next: Znakowanie DNA metodą random Up: Hybrydyzacja Southerna Previous: Hybrydyzacja Southerna   Spis rzeczy

Rozdział i transfer DNA

Genomowe, wysokocząsteczkowe DNA roślin i komórek trawiono przez noc odpowiednim enzymem restrykcyjnym, a produkty trawienia rozdzielano na 1,2 % żelu agarozowym zawierającym bromek etydyny. DNA w żelu poddawano depurynacji za pomocą 0,25 M kwasu solnego (przez 10 minut z mieszaniem), po czym przez godzinę prowadzono denaturację DNA w roztworze I (1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH). Żel przepłukiwano wodą destylowaną i poddawano dwukrotnej neutralizacji przez 40 minut w roztworze II (1 M Tris (pH 8,0), 1,5 M NaCl), płucząc żel wodą destylowaną pomiędzy zmianami roztworu. Żel równoważono przez 20 minut roztworem III (20x SSC, 4 M NaCl, 0,3 M cytrynian sodu, pH 7,0), układano go na bibule zanurzonej na końcach w roztworze III, a następnie umieszczano na nim wypłukany w wodzie i roztworze III filtr (membranę) nylonowy (MSI, Hybond). Filtr przyciskano trzema arkuszami bibuły chłonnej Whatman 3MM zwilżonej roztworem III i 3 warstwami pieluszek higienicznych, obciążając całą konstrukcję ciężarkiem o masie ok. 0,5 kg. Transfer DNA z żelu na filtr prowadzono przez noc, po którym to czasie na filtrze zaznaczano ołówkiem kieszonki żelu, filtr zapiekano w świetle ultrafioletowym przez 3 minuty (unieruchamiając na nim związane DNA) i pozostawiano go do wyschnięcia.


Next: Znakowanie DNA metodą random Up: Hybrydyzacja Southerna Previous: Hybrydyzacja Southerna   Spis rzeczy
Tomasz Calikowski 2000-06-15