Spis rzeczy

Znakowanie DNA metodą random priming

Sondy molekularne do hybrydyzacji przygotowywano za pomocą zestawu do znakowania DNA wykorzystującego oligonukleotydy o losowych (przypadkowych) sekwencjach. Oligonukleotydy takie przyłączają się do jednoniciowego DNA, a następnie podlegają wydłużaniu wskutek działania polimerazy DNA (tkz. fragmentu Klenowa). Do znakowania wykorzystywano radioaktywny izotop fosforu ?32P, włączany do nowopowstającej komplementarnej nici DNA, oraz oligonukleotydy o długości dziesięciu nukleotydów (dekanukleotydy). Posługiwano się zestawem firmy Fermentas (Wilno, Litwa) DNA Labelling Kit. Mieszanina reakcyjna zawierała: 100 ng DNA (3 l), 10 ?l mieszaniny dekanukleotydów i wodę do 40 l. Mieszaninę ogrzewano do 100C przez 10 min, a następnie wstawiano do lodu. Dodawano pozostałe składniki: 3 l mieszaniny nukleotydów (MixA), 3 ?l (30 ?Ci) [?32P] dATP (Amersham, NEN, ICN) 3000 Ci/mmol, i 1 ?l polimerazy Klenowa (3 U/?l). Reakcję prowadzono przez 10 minut w 37C. Po jej zakończeniu do próbki dodawano 4 ?l mieszaniny wszystkich nukleotydów (dNTP) i prowadzono dalszą reakcję w 37C przez 5 minut. Reakcję zatrzymywano dodając 1 l 0,5 M EDTA, pH 8,0. Wyznakowany DNA oddzielano od niewbudowanych trójfosforanów nukleozydów na kolumience wypełnionej Sephadexem G-50.

  Spis rzeczy