Spis rzeczy

Prehybrydyzacja i hybrydyzacja

Membranę z zapieczonym DNA umieszczano w butelce do hybrydyzacji (Hybond), do której wlewano porcję roztworu do prehybrydyzacji (5x roztwór Denhardta (1% Ficoll 400, 1% PVP (poliwinilopirolidon), 1% BSA (albumina z surowicy bydlęcej)), 5x SSC (0,75 M NaCl, 0, 075 cytrynian sodu, pH 7,0), 0,1 mg/ml jednoniciowego DNA z grasicy cielęcej, 0,5 % SDS). Prehybrydyzację prowadzono w temperaturze 65C. Po 2 godzinach roztwór do prehybrydyzacji zmieniano na roztwór do hybrydyzacji: 5x roztwór Denhardta, 5x SSC, 0,1 mg/ml DNA z grasicy cielęcej, 0,1% SDS, zawierający jednoniciową (zdenaturowaną) sondę molekularną wyznakowaną metodą random priming. Hybrydyzację prowadzono przez noc w temperaturze 65C. Po jej zakończeniu membranę płukano (w temperaturze 65C) kolejnymi roztworami o malejącej sile jonowej: 1 godzinę 3x SSC (0,45 M), 0,1% SDS, 1 godzinę 2x SSC (0,3 M), 0,1 % SDS i pół godziny 1x SSC (0,15 M), 0,1% SDS. Membranę umieszczano w woreczku plastikowym i eksponowano w kasecie PhosphorScreen (Molecular Dynamics, USA) przez ok. 1 godzinę, odczytując ją następnie za pomocą urządzenia PhosphorImager (Molecular Dynamics, USA). Do analizy obrazu używano programu ImageQuant tej samej firmy.

  Spis rzeczy