Next: Ekstrakcja całkowitych histonów z Up: Materiały i metody Previous: Prehybrydyzacja i hybrydyzacja   Spis rzeczy

Ekstrakcja histonu H1 z roślin i komórek BY-2 tytoniu

Do ekstrakcji histonu H1 wykorzystywano fragmenty liści lub kwiatów kilkutygodniowych roślin tytoniu rosnących w warunkach szklarniowych lub rośliny otrzymane z nasion skiełkowanych w pożywce płynnej. W tym ostatnim przypadku nasiona tytoniu wysiewano do pożywki płynnej MS, do linii transgenicznych dodając odpowiednie antybiotyki selekcyjne (kanamycyna do stężenia końcowego 100 \( mu \)g/ml) w celu selekcji rekombinantów. Hodowlę siewek prowadzono w temperaturze 21\( ^{o} \)C ze zmiennym fotoperiodem (16 godzin dzień / 8 godzin noc), w wytrząsarce przez 14 dni. Po tym czasie młode rośliny zbierano na bibułę i odsączano od pożywki odrzucając rośliny niezrekombinowane (łatwe do odróżnienia dzięki jasnemu zabarwieniu). Izolację histonów łącznikowych prowadzono zgodnie z procedurą opisaną przez Mazzoliniego i współpracowników (1989). Do jednej preparatyki używano zwykle ok. 3 g tkanki roślinnej, zaś w przypadku preparatyki histonu H1 z kwiatów ok. 1 gram (3 kwiaty, o średniej masie ok. 300 mg). Rośliny cięto skalpelem na wąskie paski, dodawano 3 ml 5% kwasu nadchlorowego (PCA) i homogenizowano za pomocą urządzenia Ultrathurax Polytron T25 basic (IKA, Niemcy) przez 1 minutę przy maksymalnych obrotach (28000 obrotów na minutę). Dalsze etapy procedury były wspólne dla roślin i dla komórek. Komórki BY-2 po tygodniowej hodowli w 28\( ^{o} \)C z wytrząsaniem (150 obrotów na min) osadzano w cylindrze i odsączano od pożywki, a następnie homogenizowano w homogenizatorze Ultrathurax Polytron T25 basic (IKA, Niemcy) w równej objętości 10% kwasu nadchlorowego (PCA) (stężenie końcowe 5%), po czym ekstrahowano około 10 godzin z mieszaniem w 4\( ^{o} \)C. Ekstrakt odwirowywano dwa razy przy 10000 obrotów na minutę (4\( ^{o} \)C) odrzucając osady, a supernatant filtrowano przez dwukrotnie złożone warstwy materiału filtracyjnego Miracloth. Do roztworu dodawano 100% kwas trójchlorooctowy (TCA) do końcowego stężenia 18% TCA i wytrącano białko przez 4 godziny w 4\( ^{o} \)C. Roztwór odwirowywano przy 12500 obr/min przez 40 minut, po czym osad zawieszano w małej objętości zimnej, sterylnej wody i dializowano wobec wody (z dodatkiem 0,1 mM PMSF i 0,01 M H2SO4) przez 3 godziny a następnie zatężano w wirówce próżniowej do objętości około 100 \( mu \)l. Próbkę rozdzielano na żelu poliakrylamidowym.



Subsections
Next: Ekstrakcja całkowitych histonów z Up: Materiały i metody Previous: Prehybrydyzacja i hybrydyzacja   Spis rzeczy
Tomasz Calikowski 2000-06-15