Spis rzeczy

Ekstrakcja całkowitych histonów z chromatyny

W celu otrzymania całkowitych histonów roślin i komórek tytoniu przeprowadzano izolację chromatyny, z której następnie selektywnie ekstrahowano białka zasadowe, należące w większości do grupy histonów. Do preparatyki przeznaczano 3 g liści tytoniu, lub ok. 4 ml gęstej zawiesiny komórek (masa po odsączeniu ok. 3 g). Procedurę prowadzono zgodnie z opisem Moehsa i współpracowników (1988). Materiał homogenizowano w 200 ml buforu I (0,4 M sacharoza, 10 mM Tris HCl pH 8,0, 10 mM MgCl2, 5 mM -merkaptoetanol, 2 mM fluorek fenylometylosulfonowy (PMSF)), w homogenizatorze Waringa cztery razy po 30 sekund. Homogenat przesączano przez dwie warstwy gazy i jedną warstwę materiału do filtracji Miracloth (Calbiochem) i wirowano przez 10 min, przy 10000 obrotów na min w temperaturze 4C. Osad zawieszano w 150 ml buforu II (0,25 M sacharoza, 10 mM Tris HCl, 10 MM MgCl2, 1% Triton X-100, 2 mM ?-merkaptoetanol, 2 mM fluorek fenylometylosulfonowy (PMSF)) w homogenizatorze Waringa prowadząc rozdrabnianie cztery razy po 15 sekund. Po ponownym wirowaniu w identycznych warunkach, osad przenoszono do homogenizatora Pottera i ekstrahowano go przez dwie godziny na mieszadle magnetycznym 15 ml 0,4 M kwasu siarkowego. Próbki następnie wirowano (18000 obrotów na minutę, 30 min, 4C), odrzucano osad, a wyekstrahowane białka z supernatantu wytrącano na mieszadle magnetycznym przez noc 3,5 objętościami  zimnego acetonu. W dalszej kolejności preparaty poddawane były wirowaniu (18500 obrotów na minutę, 30 min), osad był suszony zimnym powietrzem i rozpuszczany w małej objętości zimnej wody. W celu usunięcia kwasu i doczyszczenia, próbki poddawano przez 2 godziny dializie wobec wody. Po zatężeniu w wirówce próżniowej preparaty podlegały rozdziałowi na żelu poliakrylamidowym.

  Spis rzeczy