Spis rzeczy

Izolacja plazmidowego DNA z Escherichia coli na małą skalę (miniprep), za pomocą lizy alkalicznej.

Kolonie bakteryjne otrzymane po nocnej hodowli na odpowiednich podłożach selekcyjnych szczepiono do 3 ml płynnej pożywki LB zawierającej właściwy antybiotyk selekcyjny. Hodowlę prowadzono przez noc w temperaturze 37C, z intensywnym wytrząsaniem (150 obrotów na minutę). Zawiesinę bakteryjną zwirowywano w mikrowirówce laboratoryjnej, osad zawieszano w 100 ?l buforu I (25 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM glukoza, 10 mM EDTA), dodawano 5 l RNazy (10 ?g/ml) i pozostawiano w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Następnie dodawano 200 l świeżo przygotowanego roztworu do lizy alkalicznej (roztwór II, 0,2 M NaOH, 1 % SDS), próbki mieszano bardzo delikatnie i pozostawiano w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Po tym czasie dodawano 150 l zimnego roztworu neutralizującego (roztwór III, 7,5 M octan amonu), silnie wstrząsano i pozostawiano w lodzie na 10 minut, po czym próbki wirowano przez 15 minut w mikrowirówce laboratoryjnej i zbierano klarowny supernatant. Do niego dodawano 900 l zimnego, 96% etanolu; próbki dokładnie mieszano i pozostawiano w temperaturze -20C na pół godziny. Preparaty podlegały następnie odwirowaniu (przez 15 minut), etanol był usuwany, zaś osad przemywany delikatnie 70 % etanolem i suszony przez 5 minut w wirówce próżniowej SpeedVac (Savant). W końcu, plazmidowe DNA zawieszano w 50 ?l buforu TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,0; 1 mM EDTA) lub w sterylnej wodzie destylowanej.

  Spis rzeczy