Spis rzeczy

Izolacja plazmidowego DNA z Agrobacterium na małą skalę (miniprep).

Plazmidowe DNA z Agrobacterium tumefaciens (szczep LBA4404) izolowano na małą skalę za pomocą zmodyfikowanej i udoskonalonej lizy alkalicznej. Agrobacterium hodowane było w 20 - 40 ml pożywki płynnej YEB z odpowiednimi antybiotykami selekcyjnymi (rifampicyna do stężenia końcowego 25 g/ml, i jeśli było to potrzebne, kanamycyna do stężenia końcowego 50 g/ml, higromycyna do stężenia końcowego 50 g/ml) z silnym wytrząsaniem przez 48 godzin w temperaturze 28C, po czym hodowla wirowano przy 5000 rpm przez 10 minut w temperaturze 4C, pożywkę odrzucano, zaś pelet (osad) bakteryjny zawieszano w 10 ml lodowatego 0,1% sarkozylu i ponownie odwirowywano jak poprzednio. (Przemywanie sarkozylem umożliwia działanie lizozymu i usuwa resztki pożywki, które mogłyby utrudniać trawienie restrykcyjne otrzymanego plazmidu). Osad odsączano od śladów pożywki i zawieszano natychmiast w 500 l lodowatego buforu I (100 g/ml RNaza A, 50 mM TrisHCl, 10 mM EDTA, pH 8,0) z dodanym lizozymem z białka kurzego jaja (100 g/ml, Sigma). Do próbek dodawano 1 ml świeżo przygotowanego buforu do lizy alkalicznej (200 mM NaOH, 1% SDS) i delikatnie mieszano, a następnie pozostawiano bakterie na 5 minut na lodzie (liza alkaliczna). Po próbek dodawano 750 l buforu do neutralizacji (7,5 M octan amonu) wysyconego zbuforowanym fenolem (pH 8,0), mocno wytrząsano i po 15 minutowej inkubacji na lodzie zwirowywano przy 7000 rpm przez 10 minut w 4C. Supernatant ekstrahowano równą objętością mieszaniny chloroformu i alkoholu izoamylowego (24:1) i zwirowywano przy 14000 x g przez 10 minut w celu rozdziału fazy organicznej od wodnej. Ekstrakcję chloroformem:alkoholem izoamylowym powtarzano przynajmniej jeden raz w celu usunięcia śladów fenolu, po czym strącano DNA 2,5 objętościami 96% etanolu przez 20 minut w temperaturze 20C. Następnie próbkę wirowano (13000 x g przez 20 minut, 4C), przemywano 70% etanolem, suszono osad strumieniem zimnego powietrza i zawieszano DNA w 30l buforu TE (10mM TrisHCl, pH 7,5; 1 mM EDTA).

  Spis rzeczy