Spis rzeczy

Transformacja komórek tytoniowej linii BY-2

Do transformacji wykorzystywano bakterie Agrobacterium pochodzące z nocnej hodowli w pożywce YEB z dodatkiem odpowiednich antybiotyków selekcyjnych (temperatura hodowli 28C, intensywne mieszanie 150 obrotów na minutę) oraz zawiesinę komórek tytoniu linii BY-2 przesianą do świeżej pożywki MS 3 - 4 dni wcześniej. 4 ml zawiesiny nanoszono na szalki Petriego, dodawano 1 l/ml 20 mM acetosyringonu (3,5-dimetoksy-4-hydroksyacetofenon, Aldrich, roztwór etanolowy) (acetosyringon indukuje geny wirulencji Agrobacterium niezbędne do transferu kasety transformacyjnej), a następnie kilkunastokrotnie (zwykle 16-20-krotnie) pipetowano komórki za pomocą pipety o objętości 10 ml i o ostrym zwężonym otworze (wprowadzanie małych uszkodzeń w ścianach komórkach w celu indukcji genów wirulencji Agrobacterium). Do zawiesiny komórek dodawano 75 l (przy gęstym wzroście) lub 100 l (przy rzadkim wzroście) Agrobacterium i mieszano dokładnie zawiesiny na szalce. Jako kontrolę transformacji stosowano komórki BY-2 bez dodatku Agrobacterium. Szalki zabezpieczano parafilmem i hodowano 3 dni w 28C (kokultywacja) po czym przerośniętą bakteriami kulturę komórek BY-2 spłukiwano silnym strumieniem pożywki MS-BY-2 z dodatkiem karbenicyliny lub claforanu (stężenie końcowe obu antybiotyków 500 g/ml) (pożywka MSC) i przenoszono do sterylnych probówek o objętości 50 ml (typu Falcon) uzupełniając je świeżą pożywką do pełna. Następnie probówki odwirowywano (1000 obrotów na minutę, rotor typu swing-out, temperatura pokojowa) albo pozostawiano na 10 minut w komorze z przepływem laminarnym (warunki sterylne) (osadzanie grawitacyjne komórek tytoniu). Następnie odsysano pożywkę zawierającą bakterie, uzupełniano probówki świeżym MSC i dwukrotnie powtarzano odpłukiwanie bakterii (w sumie odpłukiwanie wykonywano trzykrotnie). Komórki zawieszano w małej objętości pożywki MSC (2 - 5 ml) i wysiewano około 0,5 ml zawiesiny na szalki ze stałym podłożem MS z dodatkiem karbenicyliny lub claforanu (500 g/ml) i kanamycyny (100 g/ml), zwracając uwagę na rzadkie rozmieszczenie wysianych komórek na szalce. Szalki pozostawiano uchylone do wyschnięcia i zabezpieczano parafilmem. Hodowlę prowadzono przy 28C przez 3 - 4 tygodnie aż do utworzenia się żółtawych grudek komórek (pseudokallusów), które poddawano dalszym badaniom.

  Spis rzeczy