Spis rzeczy

Izolacja genomowego DNA roślin i komórek tytoniu.

W celu izolacji genomowego DNA roślin i komórek tytoniu wykorzystywano metodę Dellaporty i współpracowników (1983). Do preparatyki używano ok. 3 - 5 g świeżych liści tytoniu, lub ok. 4 g świeżej, tygodniowej zawiesiny komórkowej. Materiał roślinny zawieszano w 15 ml buforu do homogenizacji (100 mM Tris pH 8,0, 50 mM EDTA 500 mM NaCl, 10 mM -merkaptoetanol) i homogenizowano w urządzeniu Ultrathurax T25basic przez 30 sekund i liczbie obrotów na minutę równej 24000. Do homogenatu dodawano 1 ml 20% SDS, mieszano dokładnie i inkubowano próbki w temperaturze 65C przez 10 minut. Następnie dodawano 5 ml 5M octanu potasu, próbki mieszano i schładzano w lodzie przez 20 minut, po czym je wirowano (15000 obrotów na minutę, 20 min, 4C) i filtrowano przez jedną warstwę materiału filtracyjnego Miracloth (Calbiochem). W celu strącenia DNA do filtratu dodawano 10 ml zimnego izopropanolu i pozostawiano w temperaturze -20C przez godzinę, po czym próbke wirowano przez 15 minut przy 13500 obrotów. DNA przepłukiwano 70% etanolem, suszono zimnym powietrzem i zawieszano w małej objętości wody lub 10 mM TrisHCl, pH 8,5. Jeżeli po strąceniu izopropanolem próbki zawierały ciągnący się osad polisacharydów ekstrahowano je dwukrotnie mieszaniną fenolu, chloroformu i alkoholu izoamylowego (25:24:1), a DNA z fazy wodnej strącano 1 objętością izopropanolu i 1/10 objętości 3 M octanu sodu (pH 4,8). Przed trawieniem enzymami restrykcyjnymi genomowe DNA poddawane było oczyszczeniu z RNA za pomocą trawienia RNazą (10 mg/ml, Sigma). Do próbek dodawano 3 l roztworu tego enzymu.

  Spis rzeczy